Введение к работе
Актуальность проблемы. Структурно-динамическая организация белков, представляющая собой фундаментальную проблему современной биохимии, включает баланс межмолекулярных взаимодействий как внутри белка, так и в его микроокружении. Для направленного изменения свойств белков наряду с генной инженерией и белковым дизайном одним из перспективных подходов считается "дизайн среды", который предполагает многообразие методов в использовании неводных реакционных сред: мицелл, микроэмульсий, индивидуальных органических растворителей и их смесей, или водно-органических растворов. Моделирование физико-химических свойств среды для ферментативного катализа путем введением органических растворителей в последнее время получило широкое распространение, поскольку помимо практического применения в биотехнологии и медицине, позволяет моделировать многие биохимические процессы и получить информацию о ферментах зачастую недоступную в рамках традиционной энзимологии.
Люциферазы из разных видов светящихся бактерий катализируют реакцию окисления длинноцепочечного алифатического альдегида до соответствующей жирной кислоты с излучением квантов света. Способность люцифераз трансформировать энергию химических связей в световую позволяет считать этот фермент уникальным объектом научных исследований. Сравнительное изучение кинетических параметров реакций люцифераз из двух видов светящихся бактерий P.leiognathi и V.harveyi в водно-органических средах позволяет оценить роль воды и объемных характеристик среды (гидрофобности, диэлектрической проницаемости, способности образовывать водородные связи) в поддержании каталитически активной структуры ферментов и выяснить природу формирования фермент-субстратного комплекса.
Цель работы. Целью данной работы является сравнительное изучение кинетики реакции люцифераз из двух видов светящихся бактерий при направленном изменении реакционной среды с использованием органических растворителей.
Основные задачи исследования:
-
Исследовать динамику кинетических параметров люцифераз из двух видов светящихся бактерий Photobacterium leiognathi и Vibrio harveyi при введении органических растворителей в реакционную среду.
-
Проверить применимость термодинамической модели влияния органических растворителей на белки для прогноза денатурирующего действия растворителей на люциферазы.
-
Сопоставить кинетические параметры реакции, характеризующие различные стадии биолюминесценции, со следующими параметрами органических растворителей: параметром гндрофобности (-logP), способностью образовывать водородные связи, донорно-акцепторными свойствами растворителей и диэлектрической проницаемостью.
-
Определить типы взаимодействия органических растворителей с лю-циферазами по отношению к альдегидам разной длины цепи.
Научная новизна. Выявлены особенности влияния органических растворителей на кинетику реакции двух бактериальных люцифераз из двух видов светящихся бактерий P.leiognathi и V.harveyi при использовании альдегидов с разной длиной цепи. Показана значительная активация интенсивности свечецня люцифераз при введении небольших концентраций органических растворителей. Методами кинетического анализа определены типы взаимодействия (активации -и ингибирования) органических растворителей с люциферазами и установлено, за счет каких взаимодействий (гидрофобных или электростатических) происходит образование фермент-субстратных комплексов люцифераз с альдегидными субстратами.
Практическая значимость. Введение органических растворителей в реакционные смеси позволяет оптимизировать условия реакции, в частности, увеличивать скорость реакции. Показана возможность применения параметров гидрофобности и денатурирующей силы растворителя для качественной оценки их инактивирующего действия на люциферазу.
Положения, выносимые на защиту.
Изменение кинетических параметров биолюминесцентной реакции, катализируемой люциферазами из двух видов светящихся бактерий P.leiognathi и I'.harveyi, в водно-органических средах определяется балансом гидрофобных и электростатических взаимодействий, и вытеснением воды из гидратной оболочки белка. За счет этого, вероятно, происходят конформационные изменения люцифераз. Стабилизация долгоживущего интермедиата определяется донорно-акцепторными свойствами растворителей.
Структурные особенности двух видов люцифераз проявляется в том, что люцифераза 1 '.harwyi более устойчива к действию органических растворителей и величина активирующих и ингибирующих эффектов растворителей на биолюминесценцию определяются: для люциферазы P.leiognathi - длиной цепи используемого альдегида, для люциферазы V.harveyi - природой растворителя.
Введение органических растворителей характеризуется различными типом взаимодействий люцифераз с эффекторами и зависит от их концентрации и используемого субстрата. Взаимодействие люциферазы V.harveyi с Си и Сю имеет преимущественно гидрофобную природу, и люциферазы P.leiognathi с Си -гидрофобную, а с Сц и Сю - электростатическую.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на Международной конференции "Biocatalysis^'XCysflanb, 1995), на 9-ом (Массачусетс, США, 1996) и 10-ом (Бологна, Италия, 1998) Международных симпозиумах по биолюминесценции и хемилюминесценции, на XIII Международном биофизическом конгрессе (Нью Дели, Индия, 1999), на I Всесибирском конгрессе женщин-математиков (Красноярск, 2000).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения и трех глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 126 страницах маши-