Каталитический центр a-химотрипсина как открытая квантовая система Шувалова Екатерина Викторовна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Общие сведения об а -химотрипсине (литературный обзор)... 15.

1.1. Сериновые амид гидролазы. Протеолитические ферменты пищеварительного траста 15

1.2. Субстраты 16

1.3. Строение сериновых протеаз 17

1.4 Особенности пространственной структуры а -химотринснна. Блочная модель. Кластерная динамика а -химотрипсина 18

1.5 Активный центр а -химотрипсина 21

1.6. Последовательность химических и конформационных превращений каталитического акта а -химотрипсина 25

1.7. Ферментативный гидролиз а -химотрипсина. Феноменология... ЗI

1.8 Выводы 35

1.9 Предпосылки к построению модели 36

Глава 2. Модель фермент-субстратного комплекса а химотрипсина 38

2.1. Модель: а - химотрипсин- «молекулярные ножницы» 38

2.2 Профили поверхности потенциальной энергии водородной связи Serl95-His57 фермент-субстратного комплекса а-химотрипсина .. 40

2.3 Модель стохастического потенциала каталитического центра 44

2.4 Резюме

2.5 Постановка модельной задачи. Водородная связь (Ser^SJO* -Н NE2(His57) как квантовая открытая для взаимодействия с окружением система 54

Глава 3. Свойства и математические методы описания управляемой бистабильной системы. 55

3.1 Классическая диффузионная модель Крамерса 55

3.2 Обобщение модели Крамерса 57

3.3 Квазиклассические методы расчета скорости перехода через потенциальный барьер . 64

3.4 Двухуровневое приближение 61

3.5 Квазиэнергия и квазиэнергетические состояния Флоке в периодическом поле 68

3.6. Метод расщепления оператора эволюции 71

3.7 Выводы 79

3.8 Задачи численного моделирования 81

Глава 4. Численное моделирование эволюции управляемой бистабильной квантовой системы каталитического центра а-химотрипсина 83

4.1 Одномерная стационарная задача. Амплитудно-частотная характеристика 83

4.2 Гармоническое управляющее воздействие 87

4.3 Гармоническое воздействие в численном эксперименте 99

4.4 Воздействие со спектральной линией конечной ширины 102

4.5 Моделирование кластерных колебании. Шум 107

4.6 Асимметричный потенциал 113

4.7 Аддитивное внешнее поле, изменяющее разность глубин ям 115

4.8 Импульсное воздействие (Pulsc-shapcd controlled tunneling) 117

4.9 Редуцированная 3-ёхуровневая квантовая модель релаксации... 120

4.10 Двумерная задача 123

4.11 Выводы 125

4.12 Задачи будущего моделирования 127

Таблица 41.

Заключение 130

Литература

• Особенности пространственной структуры а -химотринснна. Блочная модель. Кластерная динамика а -химотрипсина
• Профили поверхности потенциальной энергии водородной связи Serl95-His57 фермент-субстратного комплекса а-химотрипсина
• Квазиклассические методы расчета скорости перехода через потенциальный барьер
• Гармоническое управляющее воздействие

Введение к работе

Актуальность

Гидролиз амидных связей в различных веществах, главным образом белках, катализируется многочисленными ферментами, амидгидрол азами. Амидгидролазы встречаются в растениях и во всех без исключения животных организмах. В частности, к группе сершювых амидгидролаз относятся протеазы системы свертывания крови, протеазы системы первичного отклика иммунного ответа у позвоночных, важные ферменты пищеварительного тракта -а-химотрипсин, и др. Реакции ферментативного гидролиза являются чрезвычайно эффективными и не могут быть воспроизведены неферментативным путем [Волькенштейн, Соболев, Голованов, 1982]. Для сравнения: период полупревращения амидной связи в воде составляет 3 года, время неферментативной, но катализируемой реакции составляет около 3 часов, скорость ферментативной реакции 1(Г^Е-Ис. Поэтому очень много внимания уделяется изучению функционирования ферментов, влиянию внешних факторов, предпринимаются попытки их использования для манипуляций с отдельными молекулами в нанобиотехнологиях [Yakushevich, 1998]. Избирательность и высокая скорость биологического ферментативного катализа определяется строением макромолекулы фермента [Антонов, 1983], [Попов, 2000]. Структура (первичная и пространственная) фермента обеспечивает эффективность каждого этапа реакции фермент-субстратного взаимодействия [Ebeling, Romanovsky, Schimansky-Geier, 2003], [Попов, 2000]: скорость диффузионного проникновения (выхода) субстрата в (из) активный (ого) центр(а) фермента на первом (последнем) этапе увеличивается за счет неоднородного электростатического

5 поля, создаваемого активным центром и поверхностью фермента, связывание субстрата сорбциопными участками обеспечивает взаимную ориентацию расщепляемых групп и каталитически активных групп фермента, необходимую для эффективного химического превращения субстрата в каталитическом центре фермента. Времена диффузионных процессов проникновения и выхода субстрата составляют 10~⁸с, диффузионные процессы можно с хорошей точностью описать диффузионными методами и методами молекулярной динамики [Ebeling, Romanovsky, Schimansky-Geier, 2003]. Связывание субстрата в активном центре фермента предполагает ряд конформационных перестроек фермента, время каждой перестройки составляет №~²+lQ~⁴c . По-видимому, конформационные изменения являются лимитирующей стадией и дают преимущественный вклад в экспериментально наблюдаемые константы скорости. Конформационные перестройки, связанные с сорбцией субстрата хорошо описываются полуэмпирическими методами конформациошюго анализа [Попов, 2000]. Времена химических превращений ферментативных реакций достигают диффузионно-контролируемых 10"⁸с. Стадию цепочки химических превращений субстрата запускает самосогласованные процессы миграции протона у -гидроксилыюй группы Serl95 из водородной связи каталитического центра (Ser\95)O^rH N*²(His57) к атому азота расщепляемой связи субстрата и образования связи между атомом кислорода серина и атомом углерода субстрата (Ser\95)O^y ~-С'(Р\). Описание химического взаимодействия между субстратом и ферментом возможно только на основе квантовых методов. Заметим, что переходы протонов играют важную роль и в функционировании ионных каналов биологических мембран [Баумуратова, 2005], [Сапронова, 2004]. В таких задачах используются дискретный подход квантовой химии и континуальный подход физики сплошных сред. Во многих случаях переходы протонов являются спусковым механизмом фазовых и конформацчонных переходов в различных биологических, физических и композитных системах. Несмотря на то, что между разными подгруппами сериповых амидгидролаз (протеазы поджелудочной железы, ферменты крови, ферменты беспозвоночных, бактериальные амидгидролазы) практически отсутствует гомология первичных структур, наблюдается сходство последовательностей в области каталитического центра, состоящего из аминокислотных остатков SerI95, His57, Aspl02 (в нумерации а -химотрипсина), N-концевого участка. Замены последовательностей (например, Asp на Gly в ацетил хол инэстеразе) при переходе из одной подгруппы в другую носят эквивалентный характер [Антонов, 1991, 1983]. Важно, что ферменты группы сериповых амидгидролаз сходны также в отношении пространственной структуры каталитически важных участков. Сериновые протеазы (а-химотрипсин, эластаза, трипсин, микробные протеазы) имеют двухдоменную структуру. Атомы кислорода (Serl95)0 и азота N(His57) находятся на разных доменах, находящихся в постоянном движении друг относительно друга вследствие столкновений с различного рода молекулами. В случае субтилизинов (к которым принадлежит ацетилхолинэстсраза) азот N(His) находится на конце длинной колеблющейся пружинки - а-спирали, другим концом прикрепленной к ферменту. Таким образом, водородная связь (Ser)O - H..,N(His) во всех сериновых амидгидролазах естественным образом оказывается подверженной влиянию окружения, а ее длина является динамической переменной величиной. В этом состоит причина противоречивости экспериментальных данных о длине

7 водородной связи серии - гистидин. Результат зависит от условий эксперимента.

Например, методами рентгеноструктурного анализа [Fersht, Blow, Fastrez, 1973],[Wright, Hess, Blow 1972] в кристаллизованном a - химотрипсине и фермент-ингибиторном комплексе длина водородной связи (Ser)0 - H...N(His) составляет 3,2А^С, полуэмпиричеекми методами [Попов, 2000] получено значение 1,6Л, для фермент-субстратного комплекса в полиакриламидном геле методами ЯМР-сиектроскопии длина связи составляла 2,5А [Cassidy, Lin, Frey, 1997,2000], [Lin, Cassidy, Frey, 1998], [Голубев и др., 1994]. Относительно других связей противоречий не существует. В этих условиях сравнение сериновых амидгидролаз с «молекулярными ножницами» [Blumenfeld, Tikhonov 1994] имеет прямой смысл. Молекулярные ножницы а -химотрипсин «разрезают» связи субстрата совершая режущие движения (движения доменов скрепленных «шарниром»). Модификация фермента и среды, в которой фермент функционирует, может влиять как на частоту колебаний кластеров (режущих движений ножниц), так и на среднюю величину раствора ножниц. Модель «молекулярные ножницы» отвечает концепции «белок-машина» [Чернавский, Чернавская 1999], [Blumenfeld, Tikhonov 1994], [Романовский, Эбелинг (ред.), 2000], которая в настоящий ммент получила всеобщее признание. Два относительно жестких домена, соединенные шарниром, исполняют роль рычагов. В макромолекуле фермента, в отличие от машин, энергия запасается и передается не с помощью напряжений и деформаций, а скорее с помощью предопределенного ряда конформациопных переходов. Количественное описание химического взаимодействия между субстратом и ферментом не возможно в рамках концепции «белок-машина».

Такое описание возможно только на основе квантовых методов.

Таким образом, пространственная структура ферментов группы сериновых амидгидролаз предопределяет специфическое взаимодействие водородной связи каталитического центра (Ser)O- H...N(His) с окружением, которое способствует повышению реакционной способности системы. В данной работе представлен один из возможных теоретических подходов к исследованию механизма миграции протона у-гидроксильной группы Serl95 а - химотрипсипа в ходе катализа: представление водородной связи (Ser)O- H...N(His) каталитического центра в виде квантовой открытой для специфического воздействия окружения системы.

Цели и задачи диссертационной работы.

Исследовать влияние пространственной структуры фермента а-химотрипсина и тепловых флуктуации микроокружения на эффективность работы каталитического центра.

Построить и проанализировать модель каталитического центра а -химотрипсипа в виде квантовой системы, открытой для влияния окружения.

Разработать и реализовать универсальный численный метод, позволяющий рассчитывать эволюцию открытой системы во внешнем поле любого типа.

Применить разработанную программу для расчета динамики протона в водородной связи каталитического центра в шумовом поле окружения.

Провести параллель с классическими и квазиклассическими методами расчета скорости перехода протона через потенциальный барьер.

С помощью численных расчетов и анализа выявить набор динамических режимов, которым подчиняется эволюция квантовой открытой системы

9 - водородная связь каталитического центра - в шумовом поле с параметрами, определяемыми условиями функционирования фермента. Установить степень соответствия с результатами экспериментов по исследованию положения мостиковых протонов каталитической триады методами ЯМР-спектроскопии. Научная новизна работы.

Разработан метод на основе классической формулы Крамерса с квантовыми поправками и учетом цветного шума для оценки эффективного барьера, скоростей перехода через барьер, критической температуры, разделяющей квантовый и классический режимы, в стохастическом потенциале.

Каталитический центр рассмотрен как квантовая открытая для шумового окружения система. Для численного расчета эволюции квантовой открытой системы - водородной связи каталитического центра -предложен модифицированный спектральный метод расщепления оператора эволюции. Для анализа результатов численного эксперимента предложена схема, аналогичная квазиэнергетическому подходу Флоке.

Показано, что внешнее поле водородной связи каталитического центра играет решающую роль в ускорении стадии переноса протона в процессе гидролиза.

Показано, что влияние стохастической кластерной динамики приводит к образованию квазисимметричной низкобарьерной водородной связи (Serl95)O...H...N(His57), обнаруженной в эксперименте в растворе методами ЯМР-спектроскопии.

Научная и практическая ценность работы. Работа представляет научную ценность, т.к. в ней: прослежена стохастическая динамика протона в шумовом поле окружения, установлена связь между пространственной структурой ферментов группы сериновых амидгидролаз и скоростью переноса протона, определена степень влияния внешних факторов, приводящих к изменению подвижности фермента и температуры среды,

10 Методы, предложенные в работе, могут помочь в выборе стратегии и определении параметров соответствующих биофизических экспериментов. Защищаемые положения: і Одно из важных динамических свойств пространственной структуры «молекулярных ножниц» сериновых амидгидролаз состоит в том, что она служит для передачи в асимметричную водородную связь каталитического центра (Serl95)0- Н.. .ЛГ(Яи57) тепловых и столкновитсльных процессов взаимодействия с окружением, которое способствует значительному увеличению скорости перехода протона в водородной связи.

Расчет и анализ временной эволюции квантовой открытой системы каталитического центра а - химотрипсина в шумовом поле окружения показал, что в системе реализуются те динамические режимы, в которых происходит равнораспределение протона в водородной связи (LHB-режимы).

Метод симметризации оператора эволюции совместно с Флоке-анализом и квазиклассическими оценками, является эффективным методом исследования эволюции квантовой открытой системы в условиях нестационарного внешнего поля.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационной работы опубликованы в шести статьях в отечественных и зарубежных изданиях [Grishanin, Chikishev, Romanovsky, Shuvalova, 2000], [Шувалова, Кубасов, Романовский, Чикишев, 2000], [Гришанин, Чикишев, Шувалова, 2000], [Романовский, Шувалова, 2002], [Chikishev, Grishanin, Shuvalova, 2003], [Shuvalova, 2003]. Докладывались на пяти международных конференциях с опубликованием тезисов:

Международная конференция аспирантов и студентов по фундаментальным наукам "Ломоносов-99"(апрель1999); 2-ой Всероссийский биофизический съезд (август 1999); 9-я Международная конференция «Математика.

Компьютер. Образование» (Пущино, 20-25 января 2002г.); The 7th World Multi-

11 Conference on Systemics, Cybernetics and Informatics Orlando, Florida, USA(27-30 July 2003); III СЪЕЗД БИОФИЗИКОВ РОССИИ (Воронеж, 24-29 июня 2004г.).

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, списка литературы и четырех приложений. Первая глава посвящена биологическим проблемам и биологическому описанию фермента а - химотрипсина. Во второй главе производится биофизическая постановка задачи. В третьей главе изложены физические методы решения поставленной задачи, В четвертой главе изложены результаты численного расчета и анализ результатов. Общий объем работы составляет 139 страниц текста, с включенными ^рисунками. Число таблиц _. Приложение 2 содержит ~>vL рисунков, приложение содержит У рисунков и приложение 4 содержит J рисунков. В Приложении 1 находятся общие сведения, такие как масса протона и т.п. Библиография состоит из наименований. Содержание работы:

Во введении (-//стр.) аргументирована актуальность, цель, научная новизна и практическая значимость проведенных исследований. Кратко изложено содержание диссертации по главам. Сформулированы положения, выносимые на защиту.

Первая глава (^ стр.) является литературным обзором и содержит разносторонний анализ различных публикаций, на основании которых ставятся и обосновываются цели настоящей работы. В главе рассмотрены: строение фермента, его функции, строение субстратов; теория образования фермент-субстратного комплекса; основные кинетические характеристики, такие как

12 скорости отдельных стадий гидролиза; влияние физико-химических свойств субстрата и фермента, а также внешних эффекторов на каталитическую активность а -химотрипсина. Рассмотрена пространственная двухдомепная структура фермента. Большое внимание уделено описанию состояний каталитически активных групп а -химотрипсина.и расщепляемой группы субстрата в ходе химического превращения субстрата. Изложена классическая теория кластерной динамики фермента. Систематизированы и обсуждены основные гипотезы о механизме химической трансформации субстрата а - химотрипсином. В конце главы изложены выводы и предпосылки для построения модели работы каталитического центра.

Вторая глава ( Н_ стр.) содержит описание модели каталитического центра фермент-субстратного комплекса а -химотрипсина. Во второй главе приводится расчет профилей поверхности потенциальной энергии и обоснование выбранной конфигурации расчета. Строится стохастическая модель взаимодействия выделенных связей каталитического центра с окружением.

Каталитический центр а -химотрипсина рассматривается как квантовая бистабильная система, управляемая шумовым воздействием окружения. В конце главы приводятся выводы и постановка модельной задачи.

В третьей главе (^ стр.) рассматривается классическая диффузионная модель

Крамерса расчета скоростей перехода через барьер, на основе которой строится модель, учитывающая квантовые и шумовые эффекты. С помощь новой модели выполняются оценки эффективного барьера, критической температуры,

Особенности пространственной структуры а -химотринснна. Блочная модель. Кластерная динамика а -химотрипсина

На основе данных рентгеноструктурного анализа [Волькенштейн,

Голованов, Соболев, 1982], [Антонов, 1983] выявлены основные особенности в пространственном строении а -химотрипсина. Два коротких а-спиральных участка расположены в С- концевой области цепи С (остатки 232 - 245) и в области остатков (165-172) (см. рис.1.4.1). Полипептидные цепи в а-химотрипсине образуют систему антипараллельных В- шпилек 7 связанных системой водородных связей. Большинство В- шпилек свернуты таким образом, что образуют два искаженных цилиндра (рис. 1.4.1). Первый цилиндр в себя включает остатки 29-112 и состоит из шести антипараллельных цепей [Havsteen, 1989]. Второй цилиндр образуется остатками 133 -230 и также включает шесть антипараллельных отрезков полипептидной цепи. Четыре из пяти дисульфидных мостиков входят в состав второго цилиндра. Гидрофобные аминокислоты ориентированы внутрь цилиндров, а гидрофильные, как правило, расположены на их поверхности. Оба цилиндра соприкасаются друг с другом. Некоторые остатки гидрофобных аминокислот ориентированы в область контакта (trp29,He47,Trp51,Val53,Phe89, Неї 03, Leul 05, Ие212)

С - концевая а-спираль также контактирует с обоими цилиндрами. В области контакта расположено большинство молекул воды, связанных с белком (рис. 1.4.2). Заметим, что все серииовые амидгидролазы (эластаза, трипсин, микробные протеазы, за исключением субтилизипов (ацетилхолинэстераза)) имеют двухдоменную структуру, с точно таким же расположением каталитической триады. Ацетилхолинэстераза, имея сходный каталитический аппарат (например, ацетилхолипэстераза: Ser200, His440, GIy327), имеет отличную пространственную структуру. У субтилизинов 7 длинных а -спиральных участков, 6 параллельных и 2 антипараллельных р-слоев, которые образуют одно гидрофобное ядро, проходящее через всю молекулу - «щель» [Антонов, 1983]. Остатки каталитической триады расположены на выходе щели, при этом Ser200 и Gly327 жестко закреплены на краю гидрофобного ядра. His440, будучи пространственно сближен с Ser200 и Gly327, закреплен на «пружине» одного из а -спиральных участков. Несмотря на отличие субтилизинов от остальных ферментов группы сериновых амидгидролаз, пространственная структура этих гидролитических ферментов определяет существенную нестационарность связи каталитического центра серии-гистидин. Рис.1.4.2 Упрощенная блочная модель двухдоменной молекулы а -хгаютрипсина( точкой в центре обозначена ось шарнира). [Ebeling,Romanovsky, Shimansky-Geier, 2003] С данными рентген оструктурн о го анализа о двухдоменной структуре фермента хорошо согласуются результаты Хавстина [Havsteen,1989, 1991], представившего графики подвижности аминокислотных остатков вдоль всей полипептидной цепи а -химотрипсина. На основе данных о третичной структуре фермента в работе [Хургии, Бурштсйн, 1974], [Ebeling,Romanovsky, Shimansky-Geier, 2003], [Романовский, Эбелинг, 2000] предложена упрощенная блочная модель субглобулярного строения а -химотрипсипа (рис.1.4.2). Субглобулы А и В находятся в постоянном движении относительно друг друга, при этом в роли шарнира выступают аминокислотные остатки 37-38(1 цилиндр) и 204-205(2 цилиндр). Движение субглобул носит колебательный характер. В основе движения лежат случайные столкновения с молекулами воды и субстрата. Существует версия, хотя и не общепринятая, что частоте суб глобулярных колебаний соответствуют низкочастотные линии в спектрах Рамана [Ebcling, Romanovsky,Schimansky-Geier, (eds.),2003, p.263]. Аппроксимируя рамановские спектры с помощью формулы[игаЬе et al., 1998]: (со0{ - і-ая частота в спектре, уОІ - описывает ширину линии спектра) авторы [Ebeling, Romanovsky,Schimansky-Geier, (eds.),2003, р.263] получили значения центральных частот соОІ линий спектра 10"-И0:Гц для различных ферментов, a уОІ порядка 10"Гц. Ширина линии характеризует декремент затухания колебаний. В работе [Ebeling, Romanovsky,Schimansky-Geier, (eds.),2003, р.263], [Карговский, Митрофанов, Романовский, 2006] рассмотрена двумерная модель «масса на пружинке», которая позволила оценить коэффициент затухания и собственную частоту колебаний субглобул. Субглобула массой равной половине массы глобулы а - химотрипсипа М =\2,5кД- 4 10 мг, плотностью р равной плотности воды и радиусом R«10 5CM, привязанного пружинками водородных (ЮкТ) и вандерваальсовых (0,5кТ) связей к стенке кюветы. В кювете размером LL,L = 3R умещалось N = 392 молекул воды массой m такой, что — = 100 и радиусом г — = 10. Изучалась динамика системы с учетом столкновений субглобулы с молекулами воды и столкновений молекул воды между собой (рис. 1.4.3). Видно, что в отсутствие возмущений флуктуации координат субглобулы составляют не больше 0,ЗА.

Профили поверхности потенциальной энергии водородной связи Serl95-His57 фермент-субстратного комплекса а-химотрипсина

Третичная структура молекулы а-химотрипсина обнаруживает большое количество (3-шпилек. образующих два «домена» (другое название «кластер» или «субглобула»). соединенных неупорядоченными цепями (см. рис. 1.4.1. 1.4.2 главы I). Кластеры Зет -. His 57 находятся в постоянном движении относительно друг друга, вызванном соударениями с молекулами воды и крупными молекулами субстрата. Стохастическая кластерная динамика предположительно определяется Рис. 2.1.1. Представление а химотрипсина в виде «молекулярных НОЖИЩ».

Аминокислотные остатки SerI95 и His57 находятся на разных субглобулах. частотами из диапазона 10"-1012 Гц. добротностью O \0 (см. пункт 1.4 главы I). Аминокислотные остатки SciT95 и IIis57 находятся на разных кластерах (рис. 1.4.2. 2.1.1). поэтому любое движение кластеров приводит к изменению расстояния между атомами кислорода Oy(Scrl95) и азота N;,(llis57). В этом состоит причина противоречивости экспериментальных данных о длине водородной связи серии -тистидин. Результат зависит от условии эксперимента, таких как температура, рН. вида растворителя, вида ингибитора. Гоже можно сказать и про колебания субглобул и среднее расстояние между атомами О (Serl95) и N,:(His57). Вели представить серииовыс амидгидролазы с двухдомеппой структурой в виде молекулярных ножниц, то кристаллографические данные можно отнести к полностью раскрытым неподвижным ножницам. Известно [Антонов, 1983], что в кристаллическом виде фермент не активен. Модификация фермента различными полимерными цеаями, поверхностно-активными веществами, помещение в полиакриламидный гел и различного рода растворителей, может влиять как на частоту колебаний кластеров (об изменении добротности в разных условиях [Карговский, Митрофанов, Романовский, 2005]) (режущих движений ножниц), так и на среднюю величину раствора ножниц. При чем может оказаться, что скорость гидролиза увеличивается, а может и наоборот. Например, в одном из крайних случаев с подавленными колебаниями кластеров, длина водородной связи может оказаться 3,6 А0, а в другом 1,8 А0. Если в первом случае водородной связи между серипом и гистидином не существует, то во втором, существует квазисимметричная низкобарьерная связь (Serl95)0T Н ,NE2(His57)(cM. пункт 1.6. главьіі) и положение протона близко к центральному. В обычной ситуации в невалентном комплексе реализуется слабая асимметричная водородная связь (Serl95)07 H Ne2(His57) длиной 2,7-3 А0 и асимметрией потенциала водородной связи от 10"2 -ПО ккал/моль. В таком случае1, чтобы обеспечить уход протона к NCI(His57)5 сопряжения с сильной водородной связью (His57)Nsl....H....COO(Aspl02) недостаточно. Необходимо, чтобы углерод субстрата С1 (Р1) подошел к атому кислорода (Serl95)0T ближе, чем на 1.067А0., что свою очередь, невозможно без ухода протона от атома (Serl95)0T. Выходом из «замкнутого круга» являются, на наш взгляд, именно «режущие» движения «молекулярных ножниц», которые обеспечивают возможность образования квазисимметричной водородной связи (Serl95)0Y Н NE2(His57) и являются теми решающими флуктуациями, о которых говорилось в работе [Антонов, 1983] и в пункте 1.6 Главьіі настоящей работы. Представление а-химотрипсина в виде «молекулярных ножниц» является моделью, удовлетворяющей концепции «Белок-машина» [Чернавский, 1999]. Легко оценить такие параметры кластерной динамики, как собственная частота, декремент затухания, как это сделано для х им отри псина в водном растворе в работе [Romanovsky, Rbciing. Slrimansky-Geier, 2003] (см. пункт 1.4 глины І). С другоіі стороны, представление «молекулярные ножницы» не противоречит концепции Попова [Попов, .2000] об отсутствии каких-либо напряжении, деформаций и иеравновеспостп состояний в ходе продвижения но координате реакции.

Конформациошюй подвижностью кроме Met 192 обладают только аминокислотные остатки каталитической триады His57,AspI02,Serl95 (Глава I).

Аминокислотный остаток Mell92 относится к связывающему цешру SI и на стадии химических превращении не меняет своей конформании. Укладка субстрата оказывает стсричсское воздействие на положение боковой цепи аминокислотного остатка Asp 102. Квазпсимметричная водородная связь (IHs57)N81...H...Osl(Aspl02) усиливается, т.е. уменьшается длина связи по разным источникам до 1,8-2,5 А0. В ходе химического превращения субстрата каталитической триадой конформацшо боковой цени аминокислотного остатка Asp 102 можно считать неизменной. Боковые цени аминокислотных остатков Serf 95. и п меньшей степени His57. приобретают значительную конформацпонпую подвижность после образования фермент- субстратного комплекса. Расщепляемая связь субстрата после образования невалентного фермент- субстратного комплекса пирам ндализована (см. рис. 1.6.1). т.е. амид пая связь С (Р1) — N выходит из плоскости ампдной связи (см. пункт 1.2. и 1.6 глины!). Таким образом, в ходе расчета" поверхности потенциальной оперши, соответствующей переносу протона между гидрокенльиой группой ссрина 195 п атомом азота имидазольного кольца гистидина водородной связи (Serl95)Oy - Н (1- 57), положения всех атомов, за исключением атомов (Serl95)Oy.H.N,;2(His57),N5 (His57).H(Aspl()2) и С (PI). N(P1) можно считать фиксированными. Расчетная конфигурация состояла из амидпой связи субстрата и аминокислотных остатков активного центра: His57. Scrl 95, Asp 102, Glyl93. Ser214. Для упрощения расчегов прогон сильной водородной связи (His57)N81 ...Н O,,l(Aspl02) считался неподвижным и принадлежащим аспарагипу (fiis57)Nrtl...H -Ort,(Aspl02). т.е. группа IIis-57 считалась в анионной форме. Отметим. что эффект сопряжения двух водородных (Serl95)0Y-H N :2(His57) и (His57)N5,...H O8,(Aspl02), т.е. самосогласованное движение протонов, можно учесть в ходе квантовых численных расчетов. Будем рассматривать два случая, когда расстояние между кислородом серина (Scrl95)Ov и углеродом субстрата С (Р1) составляет 3 А (равновесная копфипрация). и когда расстояние (Ser195)0T - С (PI) составляет 1.067 А0 (неравновесная конфигурация с симметричными равными потенциальными ямами).

Квазиклассические методы расчета скорости перехода через потенциальный барьер

Третичная структура молекулы а-химотрипсина обнаруживает большое количество (3-шпилек. образующих два «домена» (другое название «кластер» или «субглобула»). соединенных неупорядоченными цепями (см. рис. 1.4.1. 1.4.2 главы I). Кластеры Зет находятся в постоянном движении относительно друг друга, вызванном соударениями с молекулами воды и крупными молекулами субстрата.

Стохастическая кластерная динамика предположительно определяется частотами из диапазона 10"-1012 Гц. добротностью O \0 (см. пункт 1.4 главы I). Аминокислотные остатки SciT95 и IIis57 находятся на разных кластерах (рис. 1.4.2. 2.1.1). поэтому любое движение кластеров приводит к изменению расстояния между атомами кислорода Oy(Scrl95) и азота N;,(llis57). В этом состоит причина противоречивости экспериментальных данных о длине водородной связи серии -тистидин. Результат зависит от условии эксперимента, таких как температура, рН. вида растворителя, вида ингибитора. Гоже можно сказать и про колебания субглобул и среднее расстояние между атомами О (Serl95) и N,:(His57). Вели представить серииовыс амидгидролазы с двухдомеппой структурой в виде молекулярных ножниц, то кристаллографические данные можно отнести к полностью раскрытым неподвижным ножницам. Известно [Антонов, 1983], что в кристаллическом виде фермент не активен. Модификация фермента различными полимерными цеаями, поверхностно-активными веществами, помещение в полиакриламидный гел и различного рода растворителей, может влиять как на частоту колебаний кластеров (об изменении добротности в разных условиях [Карговский, Митрофанов, Романовский, 2005]) (режущих движений ножниц), так и на среднюю величину раствора ножниц. При чем может оказаться, что скорость гидролиза увеличивается, а может и наоборот. Например, в одном из крайних случаев с подавленными колебаниями кластеров, длина водородной связи может оказаться 3,6 А0, а в другом 1,8 А0. Если в первом случае водородной связи между серипом и гистидином не существует, то во втором, существует квазисимметричная низкобарьерная связь (Serl95)0T Н ,NE2(His57)(cM. пункт 1.6. главьіі) и положение протона близко к центральному. В обычной ситуации в невалентном комплексе реализуется слабая асимметричная водородная связь (Serl95)07 H Ne2(His57) длиной 2,7-3 А0 и асимметрией потенциала водородной связи от 10"2 -ПО ккал/моль. В таком случае1, чтобы обеспечить уход протона к NCI(His57)5 сопряжения с сильной водородной связью (His57)Nsl....H....COO(Aspl02) недостаточно. Необходимо, чтобы углерод субстрата С1 (Р1) подошел к атому кислорода (Serl95)0T ближе, чем на 1.067А0., что свою очередь, невозможно без ухода протона от атома (Serl95)0T. Выходом из «замкнутого круга» являются, на наш взгляд, именно «режущие» движения «молекулярных ножниц», которые обеспечивают возможность образования квазисимметричной водородной связи (Serl95)0Y Н NE2(His57) и являются теми решающими флуктуациями, о которых говорилось в работе [Антонов, 1983] и в пункте 1.6 Главьіі настоящей работы. Представление а-химотрипсина в виде «молекулярных ножниц» является моделью, удовлетворяющей концепции «Белок-машина» [Чернавский, 1999]. Легко оценить такие параметры кластерной динамики, как собственная частота, декремент затухания, как это сделано для х им отри псина в водном растворе в работе [Romanovsky, Rbciing. Slrimansky-Geier, 2003] (см. пункт 1.4 глины І). С другоіі стороны, представление «молекулярные ножницы» не противоречит концепции Попова [Попов, .2000] об отсутствии каких-либо напряжении, деформаций и иеравновеспостп состояний в ходе продвижения но координате реакции.

Конформациошюй подвижностью кроме Met 192 обладают только аминокислотные остатки каталитической триады His57,AspI02,Serl95 (Глава I).

Аминокислотный остаток Mell92 относится к связывающему цешру SI и на стадии химических превращении не меняет своей конформании. Укладка субстрата оказывает стсричсское воздействие на положение боковой цепи аминокислотного остатка Asp 102. Квазпсимметричная водородная связь (IHs57)N81...H...Osl(Aspl02) усиливается, т.е. уменьшается длина связи по разным источникам до 1,8-2,5 А0. В ходе химического превращения субстрата каталитической триадой конформацшо боковой цени аминокислотного остатка Asp 102 можно считать неизменной. Боковые цени аминокислотных остатков Serf 95. и п меньшей степени His57. приобретают значительную конформацпонпую подвижность после образования фермент- субстратного комплекса. Расщепляемая связь субстрата после образования невалентного фермент- субстратного комплекса пирам ндализована (см. рис. 1.6.1). т.е. амид пая связь С (Р1) — N выходит из плоскости ампдной связи (см. пункт 1.2. и 1.6 глины!). Таким образом, в ходе расчета" поверхности потенциальной оперши, соответствующей переносу протона между гидрокенльиой группой ссрина 195 п атомом азота имидазольного кольца гистидина водородной связи (Serl95)Oy - Н (1- 57), положения всех атомов, за исключением атомов (Serl95)Oy.H.N,;2(His57),N5 (His57).H(Aspl()2) и С (PI). N(P1) можно считать фиксированными. Расчетная конфигурация состояла из амидпой связи субстрата и аминокислотных остатков активного центра: His57. Scrl 95, Asp 102, Glyl93. Ser214. Для упрощения расчегов прогон сильной водородной связи (His57)N81 ...Н O,,l(Aspl02) считался неподвижным и принадлежащим аспарагипу (fiis57)Nrtl...H -Ort,(Aspl02). т.е. группа IIis-57 считалась в анионной форме. Отметим. что эффект сопряжения двух водородных (Serl95)0Y-H N :2(His57) и (His57)N5,...H O8,(Aspl02), т.е. самосогласованное движение протонов, можно учесть в ходе квантовых численных расчетов. Будем рассматривать два случая, когда расстояние между кислородом серина (Scrl95)Ov и углеродом субстрата С (Р1) составляет 3 А (равновесная копфипрация). и когда расстояние (Ser195)0T - С (PI) составляет 1.067 А0 (неравновесная конфигурация с симметричными равными потенциальными ямами).

Гармоническое управляющее воздействие

Прототипом метода, изложенного ниже, является спектральный метод Фейха и Флэка (1982) [Feit, Fleck, 1983]. Отличие спектрального метода от таких методов как метод Редукции Матрицы Плотности состоит в том, что метод позволяет вычислить волновую функцию напрямую. Подход не требует ограничений, возникающих при использовании двух/трехуровневого приближения, ограничения на размерность пространства, специального вида потенциальных функций и зависимости от времени, а также точного знания начальной волновой функции. Преимущество этого подхода состоит, во-первых, в значительной экономии компьютерного времени; во-вторых, метод подходит для решения задач с широким диапазоном потенциальных функций; в-третьих, в высокой эффективности и точности расчета; в-четвертых, не требует изначального знания базиса собственных функций потенциала и можно задавать начальную волновую функцию в любом удобном виде (например, функции Гаусса). Хотя эффективность спектрального метода (как и других методов) зависит от типа решаемых задач. Центральной частью метода является схема симметричного расщепления оператора эволюции. Задачей Фейта и Флэка было рассчитать собственные значения и собственные функции стационарного гамильтониана с помощью Фурье- анализа корреляционной функции, полученной из численного решения нестационарного уравнения Шредингера. Мы будем рассматривать нестационарный флуктуирующий гамильтониан, и решать задачу с помощью модифицированного спектрального метода Фейта и Флэка, в котором использовалась другая схема симметричного расщепления [Шувалова, 2000]. В нестационарном потенциале каталитического центра необходимо рассчитать волновую функцию. Пусть ЧУ(/ = t0 0) начальная волновая функция. Волновая функция 4 (0 - решение нестационарного уравнения Шредингера с правой частью, зависяще- символ хронологического упорядочения. Таким образом, эволюция волновой функции на временном шаге At представима в виде: у (/„ + ДО = S(A/)(/ (О = Г Ш ( + ЛГ)Л V (/0) 0-6.6) _ /[ _ Lv2 + V (F,t0 + At) ІД/ /_ _ч -53 p = — и p,F- операторы импульса, потенциальной энергии (безразмерные). Все действия, связанные с оператором импульса, имеющего вид р = -iV (в координатном представлении), удобнее выполнять в импульсном представлении, в котором оператор импульса сводится к умножению на р. Оператор потенциальной энергии V действует в координатном пространстве. Поэтому необходимо разделить операторы Р и V в (3,6.7), для того чтобы использовать волновую функцию в удобном для каждого случая представлении: импульсном или координатном. Разделение действия операторов импульса и потенциальной энергии осуществляется с помощью метода расщепления оператора эволюции. Оператор эволюции (3.6.7) расщепляется симметричным образом: iVAt /V2A/ iVAt S(A/) exp[ _ ]exP[ - i]exp[ -lSL\ (3.6.8) В [Feit, Fleck, 1983] использовалась другая форма симметричного расщепления: S(At) « exp[ - —2-]exp[ -/VA/]exp[ -І—Є-] (3.6.8a) AM AM Учитывая, что действие оператора ехр[ ] связано с преобразованием Фурье, на которое затрачивается значительная часть общего времени работы программы (особенно в многомерном случае), схема (3.6.8) в значительной мере экономит компьютерное время. В формулу (3.6.8) оператор ехр[ ] входит один раз, тогда как в (3.6.8а) входит два раза. Для вывода формулы (3.6.8) будем использовать приближенную формулу Бэйкера-Хаусдорфа, учитывая, что операторы Р и V не -І ЛІ коммутируют: е" ь &е"еье 2 (3.6.9) При этом отбрасываются члены разложения: (X2 a bl6]+(X2 [a b]!+%la bl6l6]+ 3-6-10) Таким образом, симметричная форма расщепления оператора эволюции (3.6.8) получается из общего вида оператора эволюции (3.6.7) с помощью приближенного преобразования Бэйкера-Хаусдорфа (3.6.9). Ошибку можно оценить на основании формулы остаточного члена разложения (3.6.10), взяв следующий (третий) порядок разложения (см.(3.6.9)): error « max -; [г,[ , 2], г—[л2,[р3,к1 (3.6.10а) Отбрасываемые члены (3.6.10а) имеют порядок 0[(Д/3)]. Симметричная форма преобразования позволяет избавиться от коммутаторов в (3.6.9): от времени. Особенность спектра этой функции в том, что он обладает симметрией и объем L1-1E-1Ul»1E-1Z» 10 (1 а ! 2 мИ L2 к п. . в» пр. . _/J L JD6 DtZ SODBD12 SflCE-U12n.Hz 1ДЗ&ЯЭ под главным лепестком много больше, чем под боковыми [Дженкинс, Ватте, 1980] (пример преобразования с квадратной весовой функцией на рис. 3.6.1). Таким образом, волновая функция Р(г) = ЧУ(гЖ/,, 1у, L) Рис. J. 6./ Спектр гармонического сигнала sin(9 1012 t) преобразованного с квадратной весовой функцией (3.6.17). La(a = l,2) -длина компьютерной сетки. определена на конечном объеме LXLVL:

Теоретически длина компьютерной сетки La выбирается так, чтобы волновая функция на границах была пренебрежимо малой. Поскольку часть информации теряется, необходимо оценить вклад в общую ошибку.