Введение к работе
Актуальность проблеми. В основе многих процессов.определя-ицих функционирование биоменбран и других биополішєршх комплексов лежат молекулярные движения - молекул как целого или внутримолекулярные конформационше перестройки. Характер, амплитудно-частотный спектр этих движений отражает структурную организации и кеамолекулярние взаимодействия в системе. Поэтому изучение уолокулярной динамики биомембран и модельных систем является одним ия фундаментов для поникания гахашоиа их функциони-рования.
Биоизибрака представляют собой многокомпонентные и кикро-гетерогенные систєіеі: следовательно, важной задачей является изучение динашкя отдельных компонентов системы ила отдельных участков макромолекул. Метод спиновых каток - один из наиболее адекватных для ревения этой задачи, поскольку метки или зонды могут бить в принципе введены селективно в отдельные участка кикроготерогеиной систеш ..ли іакромолекула.
Чувствительность к молекулярным вращениям обычной (линейной по СВЧ полв) ЗПР спектроскопия спиновых моток ограничена вреизнами корреляции 10" с. Это не позволяет исследовать многие функционально важмо движения а биоыоибраках (заторксгемне вря^ения белкоз, их сегіянтоз и белковых комплексов, кооперативные переориентации фосфрлипкдов), а также низкочастотные движения в липидкых слоях, стеклах, полииорах. В связи о этим актуальной проблемой является разработка методов изучения кед-ленных колекуляркых врадекий и применение ЭТИХ КОЇОДОА ДЛЯ ->0ПЗ)-ния конкретных задач структура и динамики биоыэмбран и модельных систем.
В последние годы в ЭПР спектроскопии развивается новый подход - ЭПР спектроскопия с переносом СЗЧ насыщения (Э11Р СПН), позволяюпвій повысить на 3-4 порядка, до времен корреляции 10"э--10-% чувствительность к медленным молекулярным вращеігням. 1С началу выполнения данной работ не были выяснены в дсстаточно.1 степени физические принципы этого метода и оптимальнее методо регистрации медленных движеїшЯ в биологических системах, но били развиты подходы для анализа форма спектров ЭПР с переносом нпсы» ления при изучении различных типов молекулярных движений х не
- 2 -выявлены возможности метода в биофизических исследованиях мек-Opahitux систем. -
Орчовныо задачи работы. Разработка новых экспериментальных и теоретических подходов в ЭЯ? спектроскопии спиновых МЄТОК .для изучения "сверхмедленных" молекулярных вращений (амплитудно-частотных параметров, анизотропии вращения), межмолекулярных вэаимодеРствий, релаксационных характеристик спин-меченых молекул.
Применение развитых подходов для научения закономерностей вращательной молекулярной подвижности в і.химерах, лилидных слоях, растворах глобулярных белков.
Изучение с помощью этих подходов молекулярной динамики и
ассоциации интегральных мембранных белков - Са зависимой АТФаза
сарко. іазматического ретикулуш и родопсина в фоторецопторных
мембранах - и корреляции эт х свойств в функциональными харак
тери стиками белков. '
Научная новизна. Теоретически и экспериментально развит подход для регистрации "сверхмедленных" вращений спиновых меток и аовдов, и интервале времен корреляции 10 - 10 с, основанный на измерении парь-іетровСВЧ насыщения в условиях быстрого про-. хождония через резонанс. Разработаны метода расчета спектров ЭПР ПН в модели скачкообразного вращен,.л с учетом анизотропии вращения, модуляции зеемзновского"и СВЧ полей. Для Зсм и 2мм диапазонов СВЧ предложены подходы для определения анизотропии вращения, разделения .амплитудных к частотных параметров вращения, вращения и магнитной релаксации.
Путем параллельного измерения времен корреляции вращения методами диэлектрической релаксвдии и ЭРР установлен скачкообразный характер вращения спинового зонда в жидкости.
Впервые изучона молекулярная динамика в ленгыюрозских мультиглоях липидсз. Установлена ориентация зондов в мультислое, фазовая и динамическая гогьроговность этих систем, механизм и параметры молекулярных переориентации спинокых зондов,
В полимерах вблизи и ниже точки стеклования обнаружено распределение по временам корреляции вращения спиновых меток. Выявлены суперликеннак корреляция между скоростью реакции в по-лкыере и частотой вращения в области медленных вращений и близкая к линейной корреляция в области быстрых врещений.
Предложена модель движения метки относительно белка и определена зайисимость релаксационных параметров меток от вязкое-
- о -
л их окружения.
Показано, что изиеренная методом ЭПР СПН вращательная под-ижнозть спин-меченой Са-АТФазк в мембранах саркоплазматическо-о ретикулума к протеолипосомах. соответствует внутримолекуляр-ой подвижности з гидрофильной области белка; выявлены её зави-имэсть- ст липидного окружения и конформационного состояния елка и корреляция с А?\Базной активностью. Развит подход для пределения степени ассоциации мембранных белков и определена тепень ассоциации Са-АТФазы в нативной мембране. Обнаружены аизлег-лдо SH группы в Са-АТ$аэе и показана возиожноить использования ферроиятрозильного комплекса с этими группами в ка-естве конформационно чувствительной спиновой мотки.
Обнаружена обратимая, зависящая от рН и ионной сила ассо-мация-родопсина в фоторецепторных мембранах в темнота и пока-ано.отсутствие фотоиндуцировашой ассоциации при образовании етародопсина II. С помогла сел&ктивко связанных по остаткам ."ys -140 и. t^/i—316 шток получош данные с топографии лозерх-ости родопкпна и- характере'её структурних перестроек при обра-ования иетародопсинз-П. обнаружены и изучены структурные из-вионял в фоторзцепторпых мембранах при попреждшоцом действии единого света: необратимая.агрегация родопсина к вызванные gd вменения в белко и липидисм бктлоо.
Научная и практическая ценность. Развитые з работе подходы урываю* новые методические возможности для применения ЭПР СПН иирокому кругу биологических'и физико-химических систем:био-зкбрац.и других биополккорішкомплексов; голой, стекол, полл-зроз и др. Эти подходы наили применение а совместных работах с этрудникаии Института химической физики, Института физике- :и~ кческой медицины, Института эпидемиологии,. Енологнческого фа~ рльтота МГУ, Института новых химических проблей.
Результаты по динамической и статической гетерогенности знгмзревских мультслоез следует учитывать при разработка уст-зйств молекулярной электроники на основе этих слоев.
Данные о молекулярных мэханиэмпх поврездаквдэго действия зета на фотороцепторные мзмбращ могут быть полезны для разра-этки соответствующих средств защити.
Полученные в работе результаты отражены в монографии:"Спя-звые зонды в физико-химии полимеров", используются в мотоди-эских пособиях и лекциях по биофизике фоторецепции на Биологи-5CKOM факультете МГУ.
.-4- .
Апробация работа. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзных симпозиумах и школах "Магнитный резонанс в биологии и медицине (1977, 1979, 1981, 1983, 1985, 1986), XX Международном конгресе АШЕРБ (Таллинн,19^8), Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран (Ташкент,I960), Всесоюзном биофизическом съезде (Москва,1982), Всесоюзной конференции по нитроксильным радикалам (Черноголовка,1982), Всесоюзном симпозиуме "Равновесная молекулярная динамика биополимеров (11ущино,1983), международных симпозиумах "Применение магнитного резонанса в биологии и медицине (Берлин, 1982,1984), Всесоюзной конференции по магнитному резонансу (физические аспекти)(Казань,1984), 16-й конференции ЭЕВО (Косква,1984), III Всесоюзной конференции "Физика и химия злементарн : процессов"(Ыоеквь,1987), Советско-Швейцарском симпозиуме "Биологические мембраны. Структура и функция" (Рига, I98b7.
Публикации. Материалы диссертации изложены в 46 публикациях в отечественных и оарубежшх карналах.
Личное участие автора. Материал, включенный в диссертацию, получен при непосредственном участии автора как в проведении э' зперинентов и теоретических расчетов, та., и в обсуждении ре-, зуль'^атов. При выполнении работы автором подводились итоги отдельных этапов, проводилось обобщение результатов и определялись -направления дальнейших исследований.
Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, шестк глав, общего заключения, выводов и приложений, изложенных на 310 стр. машинописного текста, содержит'МО рисунков и IS 'таблиц. Библиография насчитывает ItS наименований. В диссертации отсутствует единый литературный обзор и отдельная глава по кетодмко эксперимента, так как в каждой главе анализируются литературные данные, относящиеся к теме исследования, и имеется методическая часть, оодвр&ащая характеристику объектов и методов исследования.
В соответствии с изложенными задачами значительная часть работы г.оевшцена теоретический и методическим подходам в ЭПР СПН, которые звтем применяются для изучения систем возрастающего уровня сложности: растворов нитроксильных радикалов в вязких средах, липидных слоев, полимеров, глобулярных белков в растворе и,
наконец, нативных биомембран саркоплазматического ретикулума'и фоторецепторов. Наряду с ЭПР СПН использовалась "линейная" спектроскопия ЭПР и вспомогательные физико-химические методы. Кроме того, с целью выявления функциональной значиности молекулярной и конформационной подвижности изучали некоторые функциональные характеристики мембранних белков.