Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение энергетики взаимодействий, определяющих пространственную структуру, стабильность и функционирование нуклеиновых кислот, - одно из Лундаментальных направлений молекулярной биофизики. Целью исследований является, с одной стороны, определение термодинамических параметров этих взаимодействий: стэкинга и Н-связьтвания оснований, электростатического взаимодействия фосфатных групп и их экранировки противоионами, гидратации? а с другой - анализ энергетики различных элементов структуры нуклеиновых кислот: регулярных спиралей, "шпилек" и т.д. Их результаты используются при решении широкого круга задач - от теории денатурационных профилей ДНК (Wartell et al., 1985) до моделирования самосборки РНК в процессе биосинтеза и путей предбиологи-ческой эволюции (Orgel, 1986). Однако, несмотря на большой объем накопленной информации (Кантор, Шиммел, 1980; Hinz, 1986), оба аспекта проблемы исследованы совершенно недостаточно. Отметим хотя бы, что энергетика Г-Ц взаимодействий экспериментально изучена весьма слабо по сравнению со структурообразованием с участием А-Т и А-У пар. Практически не исследована в растворе термодинамика взаимодействия спирали с ее ион-гидратным окружением (Семенов, 1989); но и понимание энергетики более изученных стэкинга и Н-свя-зывания в нуклеотидных системах разного структурного уровня далеко от полноты.
Актуальность проблемы стала еще более очевидной в свете недавних экспериментальных исследований, обнаруживших структурную гетерогенность двойной спирали (Dickerson et al., 1982), т.е. корреляцию между первичной и вторичной структурами нуклеиновых кислот, несомненно играющую важную роль в функционировании генома. Такая корреляция определяется локальными различиями в энергетике взаимодействий вдоль полинуклеотидной цепи, которые остаются во многом неизученными.
Анализ энергетики нуклеиновых кислот проводится на разнообразиях модельных системах: мономерных ассоциатах, олигонуклеотидных, юлинуклеотидных и полинуклеотид-мономерных комплексах (Зенгер, L984) . Комплексы полинуклеотид-мономер являются простейшими си-:темами кооперативной адсорбции на линейной матрице и наиболее щекватными моделями для исследования неферментативного матричного синтеза и предбиологической эволюции. Однако этот класс спи-зальных структур изучен гораздо хуже, чем другие системы, и его 'никальные особенности не использовались в исследованиях термоди-іамики нуклеиновых кислот.
Среди экспериментальных методов исследования нужно особо выделить калориметрические, дающие прямую, не зависящую от модельных представлений, информацию. Но большая часть сведения об энергетике нуклеиновых кислот получена с помощью непрямых методов, использующих уравнение Вант-Гоффа. Сопоставление калориметрической ДН
и Вант-Гоффовской АНот, величин энтальпии оказалось весьма плодо-творным в термодинамике белков (Privalov, 1979; Sturtevant, 1987) применительно к нуклеиновым кислотам этот подход развит слабо.
Целью работы было выяснение закономерностей энергетики взаимодействий в нуклеиновых кислотах на основе анализа термодинамики модельных нуклеотидных систем. С использованием специфических особенностей комплексов полинуклеотид-мономер решались следующие основные задачи: 1) выяснение вклада энтальпийной и энтропийной составляющих электростатического взаимодействия фосфатных групп и их экранировки противоионами в энергетику спиральных структур;
-
определение с помощью прямого калориметрического метода термодинамических параметров Г-Ц взаимодействий в системах с каноническим и неканоническим спариванием оснований: Г-Ц, Ц-ЦН и Ц'Г-ЦН ;
-
выявление корреляций "химическая структура - термодинамические свойства" в АУ и ГЦ комплексах полинуклеотид-мономер при изменении (а) числа и местоположения фосфатных групп, (б) природы сахарного остатка мономера, (в) молекулярно-ионного равновесия компонентов системы; 4) анализ соотношения величин АН _ и АН , направленный на выяснение применимости модели взаимодействия ближайших соседей и модели двух состояний для описания термодинамики спирали; 5) выяснение природы кооперативности конформационных переходов в нуклеиновых кислотах, роли энтропийного фактора и проявления полярности хода цепи в энергетике рибо- и дезоксирибонуклеи-новых двойных спиралей.
Научная новизна. Впервые проведен систематический анализ термодинамики взаимодействия полинуклеотид-мономер. С помощью сканирующей микрокалориметрии определены термодинамические характеристики 14-ти трех- и двуспиральных комплексов поли(У) с адениновыми и поли(Ц) с гуаниновыми нуклеозидами и нуклеотидами, в том числе ранее не обнаруженных, а также двойных спиралей в поли(У) и протони-рованной поли(Ц).
Показано, что истинная (калориметрическая) энтальпия комплексо-
образования не меняется при изменении заряда на фосфатной группе
мономера. Обнаруженное постоянство ДН служит прямым эксперимен-
тальным доказательством энтропийного механизма стабилизации спирали за счет экранировки фосфатных групп противоионами.
Выяснены закономерности изменения степени ионизации поли(Ц)при образовании двойных и тройных спиралей с участием протонированной поли(Ц). Это позволило впервые определить истинные значения термодинамических параметров неканонических структур Ц-ЦН и Ц.Г-ЦН .
Прямым калориметрическим методом определена энтальпия Г-Ц пары в структуре двойной спирали, которая составляет 56.5 кДж/моль.
Обнаружен эффект влияния изомерии фосфатной группы в нуклеоти-дах на термодинамику их взаимодействия с комплементарными полинук-леотидными матрицами, определяющий один из возможных механизмов возникновения селективности матричного синтеза в процессе предбио-логической эволюции.
Установлен закономерный характер различий между величинами АН
и АН , свидетельствующий о неадекватности модели взаимодействия вг
ближайших соседей для описания кооперативной адсорбции на полинук-леотидных матрицах.
Выявлен реципрокный характер различий в энергетике стэкинг-кон-тактов пар оснований, различающихся полярностью хода цепи, между рибонуклеиновыми и дезоксирибонуклеиновыми двойными спиралями.
Сделан вывод о существенном вкладе ион-гидратного окружения в энергетику стабилизации спиральных структур в нуклеиновых кислотах, несводимом к взаимодействию соседних по цепи пар или троек оснований. Исходя из этого, дано объяснение высокой кооперативно-сти конформационных переходов в нуклеиновых кислотах и вариабельности величин энтропии образования различных пар оснований в спирали, которая в большой степени определяет зависимость энергетики двойной спирали от нуклеотидной последовательности.
Научно-практическая значимость работы. Термодинамические характеристики канонических и неканонических структур, определенные в настоящей работе, могут быть использованы в исследованиях вторичной структуры РНК и ДНК; при построении детальной теории денатура-ционных профилей ДНК; для анализа природы внутри- и межмолекулярных взаимодействий в нуклеиновых кислотах. Полученные данные об энергетике и закономерностях комплексообразования полинуклеотид--мономер необходимы для рационального подбора катализаторов и условий неферментативного матричного синтеза, а также для моделирования возможных путей предбиологической эволюции.
Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были доложены или представлены на Ш и V Всесоюзных совещаниях по кон-формационным изменениям биополимеров в растворе (Тбилиси, 1975 и Телави, 1980); Ш, IV и V Симпозиумах СЭВ по биофизике нуклеиновых кислот и белков (Чехословакия, 1977; ГДР, 1980 и Венгрия, 1984); Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармако-
логии (Киев, 1978) ; VIA Иенском симпозиуме "Узнавание в биополимерах" (ГДР, 1980); Международном симпозиуме по биокалориметрии (Тбилиси, 1981); Симпозиуме СЭВ по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллинн, 1981) ; IV Всесоюзной конференции по спе ктроскопии биополимеров (Харьков, 1981); I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982) ; Международной конференции "Перспективы биоорганической химии" (Рига, 1982); Всесоюзной школе по физике нуклеиновых кислот (Харьков, 1983); Международном симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворе и клетках"(Пущи-но, 1985); Международном симпозиуме "Phosphorus chemistry directe< towards biology" (Польша, 1986); Международном симпозиуме "Фиэико-химия ДНК и молекулярные механизмы функционирования генома (Тбилиси, 1987); Ш Всесоюзной конференции "Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождения жизни" (Телави, 1988); Международном симпозиуме "Взаимодействие ДНК с белками и малыми лигандами. Новые подходы" (Тбилиси, 1990) ; на семинарах и конференциях в Институте биологической физики АН СССР.
По теме диссертации опубликовано 13 статей и 18 тезисов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из разделов: Введение, Обзор литературы (2 главы), Результаты эксперимента (5 глав), Выводы, а также списка цитируемой литературы, насчитывающего 433 наименования, из них 41 отечественная и 392 зарубежных публикаций. Работа изложена на 348 стр. машинописного текста, включая 47 рисунков и 27 таблиц (список литературы занимает 45 стр.).