Энергетика, структура и природа взаимодействий ионов металлов с ДНК в растворах Брегалзе, Василий Григорьевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Создание новых физических методов исследований в биологии и их совершенствование привело к резкому углублению наших знаний на молекулярном уровне. В частности, становится все более очевидным такой факт, что ионы металлов играют важную рель в самых разнообразна биологических процессах. 'Грудно переоценить роль ионов металлов в медицине. Известно, что концентрация свободных ионов жизненеобхедиыых металлов контролируется и поддерживается в живой материи чрезвычайно тонко, и нарушение ионного баланса в.системе вызывает растройства в ней, равно как и различные функциональные растройства ведут к нарушению этого баланса. Так, например, в сыворотке крови больных некоторыми раковыми заболеваниями наблюдается повышение уровня таких элементов как медь и цинк, поэтов их изучения является актуальным для определения фактора риска на этапе диспансеризации практически здоровых лвдей в амбулаторных условиях. Кроме того представляет важность исследование количества связанного с тем или иным компонентом сыворотки биологически активных элементов при различных заболеваниях. В настоящее время широко используется лечение металлами, находят применение ионы металлов и хелаты и в химиотерапии. Хелатотерапия используется для удаления из организма токсичных ионов и металлов.

Б последнее время, в связи с особой ролью ионоб металлов в функционировании живых организмов, сформировалась новая научная дисциплина - бионеорганическая химия, которая теснейшим образом связана с молекулярной биофизикой и молекулярной биологией, поскольку связь между органикой и металлами осуществляется посучцетвом так называемой координационной связи - промежуточной по энергии между химической и вандерваальссвой - особым взаимодействием - электронно-донорно-акцепторным. Все большее внимание обращается на то, что многие ионы двухвалентных металлов 1-го переходного ряда играют важную роль в суперспиральной организации ядерной ДНК, репликации ДНК, ее транскрипции в мРНК, а также в трансляции генетического кода. Кроме этого, ионы металлов могут вызывать различного рода дефекты в структуре ДНК, такие как депуринизация, однотяжевые разрывы, ошибки а синтезе нуклеиновых кислот.

Экспериментальные изучения специфичности взаимодействия ДНІ! е ионами таких металлов как /Va (.1) » Mq(u) t Mn(iO » Co(i') Л/І (n) Cu(n) Cu(0 і Нп(і')и 4g(i) , структуры этих комплексов и энергетики связывания в них при различных внешних условиях (ионная сила, окружение, нуклеотидный состав, УФ- и га*аа>-из-лучение и др.) являются важным и актуальным в поникании организации и функционирования генома на молекулярном уровне.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось экспериментальное исследование природы вэаимодейстшш ДНК с конами УЦО* jJ^b),^M₃(H),JJLn{ti)_} Со (її), J/cO'), Си И, CttfiJ^hf'O.^I'j

В задачи работы входило: -создание новых методов исследования, давщих ноличестЕзга^в информацию о взаимодействиях ионов металлов j ДНК в водных растворах;

изучение влияния цуклеотидного состава на энергетику связи» вания;

исследование влияния ионной силы на взаимодействие ДНК е ионами металлов;

- ыяснение роли окружения иона металла на коиал^ксообразо-
вание ДНК;

исследование действия УФ- и гамма излучения на комплексы ДНК с UOi);

изучение конкурентоспособности ыезду ионами металлов и интеркакирувщими флюоресцирующими красі гєляші при взаимодействии их с ДНК;

выяснение роли гистонного кора при взаимодейетБии ионов металлов с ыононуклеосоыаш.

Научная новизна. На основе УВЧ индуктивно-связанной плаэш пониженного давленк.; в качестве оптического источника света в атокно-эмиссионном спектральном анализе созданы два новых высокочувствительных метода: импульсный (идноканальный и многоканальный) экспрессный микроанализ биологически важных ..еталлов в растворах биомакромолекул и надмолекулярных стру..гур, в том числе и в сыворотке периферийной крови, который в сочетании с равновесным диализом позволил определить константы связывания ионов металлов с ДНК, и плазменный эмиссионный метод для исследования кинетики десорбции газов и паров в изотермическом режиме и в режиме флеш-десорбции с поверхности биологических молекул и ело-

кинк соединений.

При помощи этих методов, а такзе методов У н видимой аб-гсрбциониой спестрофотометрии и флоорииетрии, получивших дальне-йзво развитие d насой работа, з п з р в и о стало возможным:

измерить термодинамические константы связывания Со (>') , jjiC„) , UlLh) и Zh[")^a №

получить концентрационные константы связывания Co(ii)_tJfi(it)_t Cu.(") ^и 2>>'"J ^с мононуклеосогаыи, выделенными из ядер клеток повзші і.ігззй линии СЗНА;

получить кривые десорбции и флеш-десорбции молекул воды с помрхности ДНК и определить энергию активации десорбции воды о

:овэрхиости увлажненных образцов ДНК ..ри разных относительные власностях и комплексов ДНК с нонами Jinlnj,7e.(ш), Со(ч)» Си (4 и'ЗьИпри относительной вла-кности 92,5 ~ охарактеризовать структуры кошлексов Со(и) , ЛЛ(",' и Си (и) о ДНК методом абсорбционной спектрометрии в видиьой и ближней ЯК областях спектра (Ы-*с1-переходы);

~ исследовать влияние , лигандного окружения, ГЦ состава на взаимодействие ионов переходных металлов с ДНК;

- изучить действие УФ и гамма-излучения (кинетические иссле
дования) на взаимодействие Си(и)о ДНК;

- показать применение экспрессного высокочувствительного им
пульсного плазменного эмиссионного метода определения ыеди в
сыворотке периферийной крови человека (691 случай) для диагнос
тики и эпидемиологических обследований в медицине.

Практическая значимость работы. Создано новое направление, заключ щееся в комплексном подходе, основанной на применении

оптического источника света в атото-эииссионном микроэлемент-ном анализе:

следовых количеств истаялоа в образцах биологического происхождения ( таких как белки, ДНК, хроьатин, выворотка крови);

концентрации ионоа металлов в экспериментах по равновесному диьдизу;

количевтяа и кинетики водяного пара, десорби^ующего с поверхности ДНК, металлокоиплвксоа ДНК и хроматина.

Использованы традиционные катоды УФ дифференциально* и видимой абсорбционной зплктрофэтоиетрии и флиюриметрии красите-

— t> —

лей, кнтеркалированных в ДНК для иссладования ьзаимодейстзия ионов металлов с биомакромолекулами и надмолекулярными соединениями в растворах, с целыз выяснения структурі^энегретики и цркро-ды связывания ДНК с иенами металлов.

Разработанный нами способ определения меди методом импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа сыворотки периферийной крови человека, позволил обнаружить цлктор риска в условиях обычной диспансеризации (691 случай), найти перераспределение кеди у человека больного лимфогранулематозом по сравнении с сывороткой здорового донора, показать достоверное увеличение меди в исследованных формах лейкозов.

Результаты этих исследований могу? иметь диагностическую ценность при эпидемиологических и клинических обелгдованиях па-циенгов. Такие исследования ведутся в настоящее время совместно с институтом гематологии и переливания крови МЗ ГССР.

На зациту выносятся следующие основное положения и результаты;

I. Разработки и создание 2-х типов атомно-эмиссиошшх спект-ррчет^лв, использующих УВЧ. индуктивно-связанную плазму пониженного давления и качестве оптического источника света;

импульсного спектрометра для элементного микроанадиза (3-5 ыкл) растворов биологических молекул, включая сыворотку крови человека, с пределом обнаружения I0~^io - Ю"**~р по абсолютной величине, и

прецизионного спектрометра для кинетических исследований десорбции паров воды с образцов биологического происхождения.

1. Разработка методики совместного использования равновесного диализа и импульсного УВЧ плазменного эмиссионного анализа для получения изотерм адсорбции ионов металлов на биомакромоле-кулех в разбавленных растворах с цель» изучения энергетики ком-плеясообразования.

2. Определена энергия гидратации ДНК, металлокомплексов ДНК и растворимого хроматина, в частности энергия активации десорбции воды, вычисленная из изотермической кинетической кривой для ткмусной ДНК равна 21,4 ккал/моль веды.

3. Исследован нелинейный характер изотерм адсорбции. Изучено влияние ионной силы, ГЦ состава, гистонового кора на энергетику связывания ионсз металлов с ДНК. Определены термодккамичес-

сие константи СйЯзыкшия ДНК из тиц/са теленка л константы связывания мононуклеосом из клеток печени мышей линии СЗНА в 0,01 М растворе J/ціІ с ионаш Со (и) ,~ЛЛ(и) ,Cut") и 2г,(и), рК которых равны для ДНК: 5,22; 5.56J 5,??; 5,I4j для ыононукяеосом -3,905 ³-"і ⁴>^І5і ³-⁶⁸- соответственно.

5. Развитие методов абсорбционной спектрофотометрии d УФ и
видимой областях спектра, применительно к слабопоглощакцнм (с
адоффициенто" молярного поглощения в пределах 2-20) и относитель
но пдохорастворимыы объектам биологического происхождения, в ча-
мноетн ДНК, а таете к спектрам поглощения, мало возмущаемая меж-
.гоязкулкрныш взаимодействиями, каповими являются взаимодействия

Jactикнетва двухвалентных ионов I-ги переходного ряда с ДНК,

6. Определены структуры комплексов Со(іі],^і(іі)и Gu(n) с ДНК льодом спзктрофотоыетрии поглощения гз видимой и ближней ИК об-та.сгях спектра. Показано, что ионы Co(nJ и J\/V(iiJ,например, взаимо- г? из? пуст є ДНК как гидратированные ионы, т.е. образует с ней снсянесферный ксіллекс. Ион СілC'iJ с ДНК ме-ют взаимодействовать непосредственно г т.е. образовывать внутрисферный комплекс.

7. Мзтсдаыи видимой и ультрафиолетовой дифференциальной спектроскопии поглощения и равновесного диализа изучена природа

СЗЗКЫОДеЙСТЕИЙ ИОНОВ УСТалЛОВ А$(ч),ьМп(іі) _гСз(п) ,-M[ltJ_t Cu(llj,

GaO) , Їм(і') Hv^Oj с ДНК: влияние нуклеотидного состава, наличии гистинового кора, ионной силы, поляризуемости иона, его заряда и лигандного окружения, концентрации иона, УФ и гамул-излу-чэняя. Показано, что действие ионов металлов на ДНК связано с одной стороны с энергетикой, структурой ц природой этих коьятде-ксов, с другой - с характерными зремекгми для внутренней по-авкэиоетн ДНК и ее групп.

8. Продемонстрирована возможность применения импульсного
УВЧ ицдуктивна-связонного пламенного атошо~зш:;сиснного анали-
з.1 ь медицине, на примере )пт)-?лсления цеди в сыворотке периферий
ной кровк практически здорових лцдей и людей больных различными
фопиаиі леЯкоз», с цэлъл обнаружить фактор риска и использовать
Ot'G для ранней диагностики лейкозов.

Структура и gfoeMjjagoTjj. Диссертация состоит из ввэдсттия, 6 глав, выводов и списка ц::тиру?кой литературы. Она сонер-хкт 291 страницу, в том ч«мо 93 рисунков, 32 таблиц и список литературы, из 241 наименований.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 33 работы, среди них 2 обзорные статьи и I авторское свидетельство.

Апробация работы. Результаты исследований, приведенных в диссертации, докладывались в виде пленарных, секционных и стендовых сообщений на следующих Всесоюзных и международных конференциях: Л, Ш, ІУ, У и УІ Всесоюзній коне; ранциях по спектроскопии биополимеров (г.Харьков, 1974, 1977, 1981, 1984, 1968){ Ш, ІУ, У и УІ Всесоюзных конференциях по конформационным изменениям биополимеров з растворах (г.Тбилиси, 1975, І977; г.Тела-ви, 1980; г.Тбилиси, 1985), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москпа, 1982), П Всесоюзном рабочем совещании по физике комплексов бкомвкроыолекул с металлами (Пущино, 1987), I Всесоюзном совещании по биофизике рака (Черноголовка,1987), научной сессии отделения физиологии и экспериментальной медицины АН ГССІ "Мялигнизация и физико-химические свойства биополимеров и их надмолекулярных структур"(Тбилиси,1987), Ш симпозиуме стран-членов СЭВ по бі физике нуклеиновых кислот (Брно,ЧССР,1977),симпозиум, по изменениям в конформациях ДНК (Брно, ЧССР, 1977).Международной конференции по квантовой химии, биологии и фармакологии (Киев, 1978), Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот (Таллинн, 1981), УІ симпозиуме по биофизике белкої и нуклеиновых кислот (Сегед, ВНР, 1983), Международной конференции пс воде и ионам в биологических системах (Бухарест, СРР,198" Ш Международной конференции по бионеоргаиической химии (Нордвех-ерхоут, Нидерланды, 1987), Международном симпозиуме по физико-хиыии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома (Тб» лиси, 1987), симпозиуме с участием стран-членов СЗВ и СФРЮ по гидратации биополимеров (цущино,1988) и Ш Международной конфереї цим по хелатам (Вашингтон, США, 1989).

Результаты докладывались на Всесоюзном семинаре по молаку-лярной физике и биофизике водных систем (Ленинград, 1989), Всесоюзных школах-семинарах по использованию ядерно-физических методов з биофизике и молекулярной биологии (ЛИЯФ:Луга,Ленинград, 1932 и пос.Усть-Нарва,ЭССР,1983), Всесоюзных семинарах по фото-нике нуклеиновых кислот (Ленинград, 1978 и 1980), Республиканской конференция по молекулярной биологии и молекулярной генетике (Тбилиси, 1977), семинаре Института биофизики АН СССР (Пущино.Ш