Введение к работе
Актуальность проблемы. Появление в ходе эволюции прост-иственно организованных многоклеточных систем (тканей) ізволило отдельным клеткам приобретать специализацию, несов-ютимую с одиночным существованием, но выгодную для системы целом. Очевидно, что разделение труда между клетками возмо-[о только при наличии надеиных иэффективных систем коммуника-ги. Специфически?.! механизмом, обеспечивающим интеграцию клеток ткани, являются проницаемые контакты (ПК) .которые позво-пот водорастворимым компонентам низкомозекулярного пула сво->дно обмениваться между цитоплазмами соседних клеток. ПК су-іствуют на разных уровнях эволюции. Это: микроплазмодесмы нит-ітих цианобактерий, плазмодесми высших растений, септальные >ры грибов, целевые контакты животных.
Информационные аспекты взаимодействий между клетками через С привлекают внимание исследователей уже более четверти века, юретический анализ разнообразных моделей связанных ПК возбу-мых тканей и экспериментальные оценки, полученные для сердца, ірвной ткани и ряда рецепторних систем, показали, что с помо->ю ПК из одинаковых возбудимых клеток могут быть организованы :ани с разными функциональными свойствами. Для невозбудимых ;аней общие модельные рассмотрения на основе представлений о їханизмах регуляции ферментативной активности также дают осно-іния считать, что в ткани из одинаковых клеток благодаря ПК >яет появиться ряд новых свойств: синхронизация клеточных ре-:ций, стабилизация ткани, локальная и обратимая специализация ;еток и т.д.
Энергетические аспекты локальных межклеточных взаимодей-'вий через ПК' до настоящего времени фактически не исследова-ісь, хотя определенные теоретические предпосылки были созданы ;е в начале 60-х годов. Так, концепция энергетического сопря-іния Питера Митчелла /ff?icfif//,I96I/ возникла как идея о том, 'о создание трансмембранной разности электрохимических потен-;алов является необходимым звеном в цепи реакций окислительно-| и фотосинтетического фосфорилирования. Развитием этой идеи іилось предположение В.П.Скулачева /I9g8/ о роли№+/К+ гради-;та на внешней мембране животных клеток: "Дуй *может исполь-шаться 1в качестве транспортабельной формы энергии, перемеща-іейся вдоль внешней мембраны клетки и даже от одной клетки к іугой через так называемые щелевые контакты внешних клеточных
мембран". Однако, исследования энергетических взаимодействий через ПК тормозились отсутствием четкой идеологии, адекватных экспериментальных моделей и соответствующих методических приемов, позволяющих анализировать динамику параметров отдельных клеток и ПК функционально активной ткани. Реальные возможности для такого анализа дает исследование относительно "автономных" тканей, то-есть клеточных популяций, непосредственно контактирующих с внешней средой: многоклеточных микроорганизмов, клеточных культур.
Настоящее исследование представляет собой обобщение концепции энергетического сопряжения Митчелла на плазматические мембраны клеток и клеточных систем, связанных ПК. Согласно этим представлениям ткань, являясь пространственно организованной системой клеток, объединенных проницаемыми контактами, энергетически не эквивалентна разобщенной популяции, а энергетический статус отдельной клетки в значительной степени определяется потоками ионов и метаболитов через ПК.
Цель и задачи исследования. Основная цель настоящей работа, - на основании анализа свойств плазматических и контактных мембран в системах невозбудимых клеток определить возможности и физиологическую значимость энергетической кооперации посредством ионных потоков через ПК.
Основные этапы исследования:
-
Теоретический анализ условий энергетической кооперации клеток, электрически связанных через ПК.
-
Разработка экспериментальных моделей и методических приемов, позволяющих исследовать свойства и функции ПК в связи с энергетическим метаболизмом у таксономически различных объектов.
-
Сопоставление аналитических оценок и экспериментальных результатов, определение энергетической значимости взаимодействий через ПК у различных объектов и в различных физиологических ситуациях.
Научная новизна, йадвинуты и обоснованы новые общие положения о перераспределении энергетических ресурсов в многоклеточных системах и установлена роль проницаемых межклеточных контактов в этом процессе.Определено основное условие энергетической кооперации электрически связанных клеток. Показано,что необходимым и достаточным условием энергетической кооперации посредством ионных потоков через ПК является наличие на плазмати-
ских мембранах контактирующих клеток дисбаланса мезкду потока-ионов через ионные насосы и "диссипаторы", что благодаря ектрогенности ионных насосов приводит к появлению электриче-ого тока через ПК. Мощность, передаваемая через ПК в виде ион-х потоков, пропорциональна электрическому току, текущему че-з ПК.
Разработаны экспериментальные модели и методические под-ды для исследования энергетических функций Ж у далеких в эво-ционном плане клеточных систем, тлеющих разное строение ПК и зличные механизмы электрогенеза плазматических мембран:
= модель смешанной культуры уабаин-чувствительных и уаба--резистентных клеток млекопитающих;
= модели интрагифального и верхушечного роста мицелиальных ибов;
= методы регистрации фотоэлектрических ответов пучков и дельных трихомов нитчатых цианобактерий при локальной засве-е.
Исследованы параметры электрической связи и перетекания рез ПК флуоресцеина у нитчатой цианобактерий Phormldium zun&tum , ряда штаммов мицелиального гриба Неигозрога ста. ,а также в монослойных культурах клеток мышей, крыс, мячка, быка, человека. Установлена близость электрических и Музионных параметров межклеточного обмена через ПК у всех следованных объектов. Показано, что постоянная длины элект-їєского кабеля у всех объектов значительно превышает размеры цельной клетки, что позволяет осуществить эффективное энерге-їєскоз сопряжение транспортных процессов в плазматических ме-ранах соседних клеток.
Показана возможность регуляции обмена через ПК у всех ис-здованных объектов. В том числе:
= обнаружена возможность регуляции межклеточного обмена зез ПК у грибов факторами внешней среды (синий свет') и эн-реншв.ш факторами (градиент электрического потенциала между зтками) ;
= обнаружена возможность усиления обмена через ПК у живот-с трехвалентным лантаном;
= обнаружена способность к репарации локально нарушенной їзи через ПК у грибов путем интрагифального роста;'
= у всех исследованных объектов обнаружено прерывание элегической связи при нарушении плазматической мембраны у одной контактирующих клеток.
3.
Проведен сравнительный анализ параметров плазматических мембран и ПК у генетически различных линий грибов (9 линий) и культивируемых клеток млекопитающих (19 линий ) :
= показана генетическая предопределенность обмена через Г
= не обнаружено корреляции между степенью опухолеродноета и обменом через ПК для культивируемых клеток лдавотных ( более 10 линий) ;
- обнаружена мутантная линия гриба /V.craiifl, WC-I, у которой дефект по электрической связи коррелирует с нарушениями фоторегуляции ряда физиологических процессов.
Исследована степень гетерогенности клеток в квазиоднородных (недифференцированных) популяциях:
= на отдельных клетках цианобактерий обнаружена пигменты; гетерогенность, коррелирующая с функциональной неоднородносты оцениваемой по спектрам действия фотоэлектрических ответов;
= обнаружена гетерогенность отдельных клеток в гифах ми-целиальных грибов по величине мембранного потенциала и прирос: входного сопротивления на свет;
= обнаружена гетерогенность отдельных культивируемых кле-ток животных.
На основании аналитических оценок и экспериментальных результатов получены количественные оценки передачи энергии чері ПК в виде ионных потоков для всех исследованных объектов: нит-чатых цианобактерий, мицелиальных грибов, культивируемых клеті млекопитающих. Показано, что мощность, передаваемая через ПК ионными потоками, соизмерима с общим энергопроизводством отдельной клетки в состоянии покоя и на два порядка превосходит возможность энергетической кооперации за счет потока через ПК макроэргов, например, АТР.
Научно-практическое значение работы. Выявление энергети ческих функций у ПК на разных ступенях эволюции и тех особенн стей тканевой организации, которые создаются благодаря взаимо действию клеток с помощью ионных потоков через ПК, является вкладом в развитие основных принципов биологии клеток и клето ных систем. Наряду с общенаучным значением полученные результ ты могут найти следующее практическое применение.
Представления об энергетической кооперации между клеткам в ткани позволяют формулировать требования к ключевым экспери ментам по выявлению реакции ткани на внешние воздействия (на пример, для определения критериев оценки активности биологиче ски активных веществ) .
4.
Смешанные культуры клеток млекопитающих с разной чувстви-льностыо к уабаину могут использоваться в лабораторной прак-іке как адекватные модели квазиоднородной ткани с функциональ-I гетерогенными клетками.
Нитчатые цианобактерии и мицелиальные грибы также могут шользоваться в лабораторной практике как адекватные модели щкционально активных тканей, обладающих ПК и состоящих из ме-іболически гетерогенных клеток.
Метод регистрации фотоэлектрических ответов одиночного три-)ма цианобактерии может быть использован для регистрации элек-жческих параметров других элонгированных микрообъектов.
Полученные в диссертации данные о генетической предопре-зленности взаимодействий через ПК у грибов необходимо учиты-іть в биотехнологии при получении и культивировании этих промы-тенно важных продуцентов биологически активных веществ.
Модель интрагифального роста мицелиальных грибов может ііь рекомендована для студенческого практикума "Рост у низших астений".
Результаты теоретического описания энергетической коопера-ли посредством ионных потоков через ПК могут быть рекомендовані в курсы лекций "Электрофизиология", "Биоэнергетика" и "Регу-яция метаболизма" для студентов, специализирующихся в области изиологии, биофизики, биохимии, цитологии.
На защиту выносятся следующие положения:
Условие энергетической кооперации в многоклеточной систе-е посредством ионных потоков через проницаемые контакты.
Экспериментальные модели энергетической кооперации, демон-трирующие пространственное разделение ионных насосов и "дисси-аторов" в многоклеточной системе:
= при активации ионных насосов у части клеток в популяции цианобактерии) ;
= при полной блокаде ионных насосов у части клеток в попу-яции (смешанные культуры уабаин-чувствительных и уабаин-рези-тентных клеток млекопитающих) ;
= при нативной сегрегации ионных насосов и "диссипаторов" (верхушка грибной гифы) .
!. Экспериментальный анализ энергетической кооперации в много-шеточной системе, включающий :
= доказательства наличия ПК меяду клетками;
= оценки кабельных параметров системы клеток, связанных ПК;
5.
6.
= регистрацию і'радиентов электрического потенциала на ПК или межклеточных токов;
= оценки функциональной гетерогенности клеток в квазиоднородной популяции;
= оценки энергетической значимости электрических токов через ПК.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 50 научных работ в отечественных и зарубежных изданиях, а также коллективная монография "Высокопроницаемце контактные мембрг ны" (под ред.Л.М.Чайлахяна) .
Апробация работы. Материалы работы докладывались на Всесоюзных конференциях "Молекулярные механизмы проницаемости мембранных структур" ( Паланга,1972, 1976, 1979), П Всесоюзном симпозиумі "Генетические и биохимические характеристики злокачественного превращения клеток" (Ленинград, 1976) , УШ Всесоюзном совещанш по эволюционной физиологии (Ленинград, 1982) , I Всесоюзном Бі физическом СЪезде ( Москва, 1982) , Всесоюзной конференции "Миц< лиальные грибы: физиология, биохимия, биотехнология" (Пуп^шо, 1983) , Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы действш оптического излучения" (Ялта, 1984) , Всесоюзной конференции "Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождения ЖИС ни" ( Петрозаводск, 1984, Телави, 1988) , Научно-практической конференции "Экстремальные условия существования микромицетов к охрана окружающей среды" (Киев, 1985) , ХП Всесоюзном совещании по транспортным АТРазам (Иркутск, 1987) , Всесоюзной конферени "Структурно-функциональная организация клеток микроорганизмов" (Пущино, 1987) , Всесоюзной конференции "Структурни-функционал ная динамика биологических мембран" (Минск, 1988) , на совмести заседании секции биохимии микроорганизмов и биохимии мембран Вс союзного биохимического общества АН СССР (Мооква, 1988) , на ме. лабораторном семинаре ИППИ АН СССР ( Москва, 1988) , заседании j учно-технического Совета Лаборатории им,А.Н.Белозерского, МГУ (1989) , совместном заседании кафедр биофизики.Влологического и Физического факультетов МГУ (1989).
Материалы работы были представлены на ІУ Международном Биофизическом Конгрессе (Москва, 1972) , Ш Советско-Швейцарском сш позиуме "Биологические мембраны: структура и функции" (Ташкент, 1983) , Ш Советско-Шведском симпозиуме "Физико-химическая биология" (Тбилиси,1984) , Международном симпозиуме Федерации европеі ских микробиологических обществ "Регуляция микробного метаболиз-
і факторами внешней среды" (Пушино, 1983) , ХУГ Симпозиуме ідерации европейских биохимических обществ (Москва, 1984) , шетско-американском семинаре "Кодирование и передача инфор-щии в биологических системах" (Суздаль, 1986) , ХІУ Микробио-ігическом Конгрессе (Манчестер, 1986) .
Материалы работы докладывались в виде лекций на школах: юсоюзной школе по межклеточным взаимодействиям ( Каунас, 1977, М, 1988) , Всесоюзной школе-конференции по биоэнергетике Карадаг, 1980, Боржоми, 1985, Дилижан, 1988) , ІУ Всесоюзной :оле молодого биолога "Регуляция в биологических системах" ;ахкадзор, 1984) , Республиканской школе "Биологические мем-аны" ( Алушта, 1982, Славск, 1984 ) .
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, ти глав, заключения и выводов. Объем диссертации 2.8^ стр., том числе 12^ стр. машинописного текста, {8 таблиц, 56 ринков, списка работ автора по теме диссертации и ГЗЗ названий тируемых литературных источников.