Введение к работе
АКТУАЛЬННОСТЬ ТЕМЫ. Известно, что у человека и высших животных многие заболевания сердечно-сосудистой системы, легких и крови, геморрагический, травматический и ожоговый шок, некоторые токсические состояния и многие функциональные нагрузки сопровождаются развитием гипоксии или ишемии. Развитие реконструктивной хирургии и транспланталогии остро ставит вопрос о расширении возможностей сохранения функциональной активности органов и тканей после временного прекращения кровотока. Именно поэтому поиск и создание эффективных антигипоксических средств имеют большое значение для биологии и медицины. Анализ литературного материала и наш собственный опыт дают основание полагать, что эффективная защита от кислородного голодания должна основываться на выработанных в процессе эволюции физиологических и биохимических механизмах [Хочачка П., Сомеро Дж., 1977]. В исследованиях последних лет было показано, что у аэробных организмов полноценное восстановление в постги-поксический период обеспечивается в большой степени сохранностью митохондрий как основной системы энергообеспечения [Regitz V. et el., 1984; Jones D.P., 1995]. В связи с этим мы полагали целесообразным сосредоточить наши усилия на изучении механизмов и поиске путей, способствующих поддержанию природных реакций, направленных на сохранение митохондрий в условиях гипоксии и ишемии. К таким реакциям, протекающим в митохондриях тканей животных без доступа кислорода, можно отнести реакции окислительного и субстратного фосфо-рилирования, поддерживаемые за счет анаэробных редокс превращений субстратов цикла трикарбоновых кислот (ЦГК) и аминокислот. Конечным продуктом таких превращений в митохондриях является сукцинат [Кондрашова М.Н. и др., 1973; Taegtmeyer Н., 1978.; Pisarenko O.I. et al., 1983]. При этом ключевое значение приобретает изучение энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината и зависимости их от энергетического состояния митохондрий, а также поддержка анаэробного образования сукцината с помощью экзогенных субстратов.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ заключалась в изучении интенсивности и энергетической эффективности различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях различных тканей животных и возможность их поддержания экзогенными субстратами.
ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ формулировались следующим образом:
1 .Выявить и проанализировать наиболее интенсивные пути анаэробного образования сукцината в митохондриях, выделенных из различных тканей животных.
2.Определить условия, при которых происходит активация и торможение путей анаэробного образования сукцината в митохондриях.
3.Сопоставить интенсивность различных путей анаэробного образования сукцината в митохондриях с их энергетической эффективностью.
4.Исследовать возможность поддержания энергетического состояния изолированных клеток животных в условиях анаэробиоза при использовании субстратов - источников сукцината.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Методом Н-ЯМР-спектроскопии показано, что образование сукцината в митохондриях печени, сердца, коркового слоя почек крыс и других животных при исчерпании кислорода или при остановке дыхательной цепи ингибиторами идет в основном тремя путями. В порядке убывания интенсивности это: одновременное восстановление оксалоацетата и окисление а-кетоглутарата, дисмутация а-кетоглутарата до глутамата и сукцината и, наконец, восстановительное обращение ЦТК.
Обнаружено явление энергетического контроля скорости анаэробного образования сукцината в митохондриях: стимуляция в присутствии акцепторов макроэргиче-ского фосфата и торможение при наличии альтернативного источника АТФ.
В отличие от сложившихся теоретических представлений экспериментально установлено, что исследованные пути анаэробного образования сукцината имеют разную энергетическую эффективность. Скорость анаэробного образования сукцината далеко не всегда соответствует энергетическому выходу, измеряемому по поддержанию концентрации АТФ или величине трансмембранного потенциала митохондрий.
Дисмутация а-кетоглутарата - весьма мощный путь анаэробного образования сукцината - в митохондриях печени энергетически не эффективна.
Впервые выявлено спонтанное чередование путей анаэробного образования сукцината в митохондриях печени, сердца и коркового слоя почек, связанное с изменением метаболического состояния митохондрий после остановки дыхательной цепи.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Определены условия, позволяющие надежно регистрировать превращения интермёдиатов энергетического обмена в изолированных митохондриях животных с помощью метода Н-ЯМР-спектроскопии.
Показано, что экзогенные NAD-зависимые субстраты и дикарбоновые аминокислоты, способные превращаться в сукцинат в анаэробных условиях, поддерживают энергетику митохондрий и целых клеток.
Выявлены ограничения по использованию экзогенного сукцината непосредственно в анаэробных условиях, связанные с тем, что он может тормозить процесс образования эндогенного сукцината, необходимый для сохранения митохондрий при остановленной дыхательной цепи.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипок-сических состояний" в Москве в 1989 г.; VI Всесоюзной конференции по биохимии мышц в Тбилиси в 1989 г.; Всесоюзном симпозиуме "Физиология и биоэнергетика гипоксии" в Минске в 1990 г.; на Международном рабочем совещании по межклеточным взаимодействиям в г. Пущино в 1994 г.; научных конференциях ИТЭБ РАН в 1993 г. и 1994 г; на 2-й Международной конференции "Гипоксия в медицине" в Москве в 1996 г.; Всероссийской конференции "Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" в г. Пущино в 1996 г.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения получен-