Введение к работе
Актуальность темы. Слияние клеток является одним из. наиболее важных инструментов клеточной биологик, биотехнологии и клеточной инженерии. Процедура слияния - ключевой этап получения гибридом, других соматических гибридов клеток растения и животных, микроорганизмов и грибов.
Традиционно слияние клеток индуцируют полиэтиленгликолем, либо вирусом Сендай. В 1979 г. было найдено, что клетки могут сливаться при коротком, но достаточно мощном электрическом воздействии. В основе электрослияния ОС) лежит приведение мембран клеток в плотный контакт и их электрическая обработка (90) импульсом высокой интенсивности (напряженность поля 1*10 кВ/см, длительность 5*150 мкс). Успешные опыты го ЭС различных растительных и животных клеток обусловили интерес к этому способу слияния. Был выдвинут ряд предположения о механизме ЭС. Тем не менее, в данной области имеются и нерешенные проблемы. Здесь следует прежде всего отметить сложность существующих методов ЭС, их недостаточную эффективность для некоторых объектов. Данные о воздействии различных факторов на процесс ЭС отрывочны и часто противоречивы. Комплексного исследования последствий 30 для клеток не проводилось, поэтому процедура ЭС во многих случаях оказывается губительной для клеток.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась разработка новых эффективных подходов к ЭС и систематическое исследова-
тае электрослияния клеток.
В связи с этим решались следутацие задачи: I. Изучение действия сильных электрических полей на клетки т определение условий, при которых повреждение клеток при ЭС w.«-
нимально.
-
Разработка методов ЭС, эффективных для широкого круга клеток.
-
Детальное изучение влияния различных факторов на процесс ЭС.
-
Выяснение возможного механизма ЭС клеток.
Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование действия импульсной электрической обработки на жизнедеятельность клеток, выяснена ключевая роль обратимого электрического пробоя плазматических мембран в электроповреждении клеток. Подобраны состав среды и условия ЭО, при которых гибель клеток незначительна и патологические изменения носят временный характер. Разработан ряд новых методов ЭС, позволяющих с высокой эффективностью сливать разнообразные клетки, с помощью этих методов получены гетерокарионы, имеющие научную и практическую ценность. Детально изучены электрические свойства клеточных осадков и ЭС при центрифугировании, зарегистрирован и исследован обратимый электрический пробой мембран клеток осадка"и показана его прямая связь с ЭС клеток. Предложен механизм ЭС, предполагающий, что в ходе электрического импульса в контактирующих клеточных мембранах образуются коаксильные поры, кромки которых замыкаются под действием сил, возникающих при прохождении тока сквозь поры.
Практическая ценность. Методы алектрослиякия клеток на проводящих подложках; при центрифугировании; пневмоэлектрический, позволяющие с высокой эффективностью осуществлять слияние как распластывающихся, так и суспензионных клеток, отличаются простотой и надежностью, дают возможность осуществлять различные ва-
рианты слияния клеток. Метод ЭС при центрифугировании уже успешно применяется в Институте молекулярной биологии АН СССР и в Институте вирусологии АМН СССР.
Рекомендации по защите клеток при 30 могут быть полезны при электрослиянии и алектротрансфекции клеток, а также при изучении действия различных повреждающих факторов (детергенты, температура, радиация и др.) на клетки.
Практическое исследование и теоретическая модель процесса ЗС углубляя» представления о функциональном строении биологических мембран и о слиянии клеток in vivo и in vitro.
Методы изучения электрических параметров клеточных осадков позволяют оценивать вязко-упругие свойства клеток и изучать обратимый электрический пробой клеточных мембран. Эти методы могут найти применение в диагностических целях.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на Всесоюзных совещаниях по биоалектрохямии (Суздаль, 1985; Ленинград, 1986; Каунас, 1967), IX Йенском международном симпозиуме ( Erfurt, GDR, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме ."Структура и функции, клеточного ядра" (Черноголовка, 1987), Всесоюзном совещании
"йіология клетки в культуре" (Ленинград, 1987), ІУ Международном Фрумкинском симпозиуме (Суздаль, 1988).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ. Описок основных публикаций приведен в конце автореферата.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, трех глав, заключения,' выводов и двух приложений (101 страница машинописного текста), 60 рисунков, II таблиц, списка литературы (189 работ).