Введение к работе
Актуальность проблеми. Известно, что большая часть ферментов обладает четвертичной (субъединичной) структурой, которая обычно необходима для проявления каталитической активности и ее регуляции.в ответ на изменение концентрации субстратов и эффектороЕ, способствует стабилизации субъединиц и определяет ряд других особенностей функционирования олигомерных ферментов. Б свою очередь некоторые ферменты способны образовывать комплексы друг с другом. Сближение ферментов одного метаболического пути в составе таких комплексов может обеспечивать увеличение скорости протекания суммарной рвакщт и сокращение потерь нестабильных метаболитов за счет уменьшения времени диффузии.
Формирование олигомерной и надмолекулярной структуры ферментов, происходящее на основе белок-белкоЕых взаимодействий, приводит во многих случаях к образованию симметричных агрегатов. Такие агрегаты связаны с выполнением вполне определенных функций, и изучение их структуры представляет актуальную задачу молекулярной биологии. Одним из наиболее эффективных методов, используемых для ее решения, является просвечивающая электронная микроскопия, которая позволяет непосредственно наблюдать изображения молекул. Возможности электронной микроскопии при исследовании структури биологических макромолекул за последние годы заметно возросли, что объясняется примененном разнообразных методов препарирвания образцов и обработки изображений.
Целью настоящей работы являлось сравнительное исследование методом элетронной микроскопии четвертичной структуры ряда ферментов четырех классов, различающихся по степени родства и происхождению, а также установление возможной связи их структуры и функций. Изучаемые ферменты участвуют е важнейших ферментативных процессах: синтезе аммиака (нитрогеназа), азотном обмене (глутаминсинтетаза, ала-ниндегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа), синтезе АТР (АТР-синтаза), фотосинтезе (карбоангидраза), ионном транспорте (Са -АТРаза), окислении ксенобиотиков (цитохром Р-450) и метана (метанмонооксигеназа) и других. Изучались также внеклеточные ферменты:р -Глюкозидаза, кислая фосфатаза и инзертаза. Мотод электронной микроскопии использовался в данной работе для непосредственного наблюдения образования комплекса двух ферментов:- глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и фосфоглицераткииазы. Изучению подобных относительно непрочных комплексов уделяется большое внимание в современной энзимологаи.
Научная новизна. В работе было проведзно определение и сопоставление четвертичной структуры (числа л расположения субъединиц) большого числа ферментов, относящихся к разным классам. Какие-либо достоверные сведения о четвертичной структуре большинства ферментоЕ к началу нашего исследования отсутствовали. Существование олигомерной структуры у мембранных монооксигеназных ферментов (цитохром Р-450 и метанмонооксигеназа) и внеклеточных ферментов (^-Глюкозидаза, кислая фосфатаза и инвергаза) было установлено впервые. Представления о структуре MoFe-белка, молекулы нитрогеназы, Pj-АТРазы, изложенное ранее другими авторами, не удолетворяли полученным нами данным, что привело к созданию их ноеых моделей. Было определено как присоединяется їе-белок к МоРе-белку и число субъединиц Ее-белка в молекуле нитрогеназы, Еыяснена стерическая возможность переноса электронов от Se-белка к MoFe-белку. Было показано двухслойное строение Pj-ATP азы, которая ранее считалась плоской. При исследовании митохондри-альной Р^-АТРазы была разработана и применена новая методика изучения локализации SH-груіш в белках с помощью ферритиновой метки, которая может найти применение в исследованиях структуры и свойств других белков. С помощью данной методики непосредственно обнаружена неэквивалентность отдельных -субъеданиц в Fj-АТРазе. Предложена модель АТР-синтазы (Рфї-рАТРазьО и выяснена ее локализация в мембране, что необходимо для понимания процессов синтеза АТР - основного источника энергии клетки.
В диссертационной работе впервые было проведено комплексное сравнительное исследование структуры мноявстеєшшх форм глутаминсинте-тазы еысших растений, одноклеточных зеленых водорослей и азотфикси-рующих клубеньков бобовых растений. Это позволило выявить наличие определенных связей между их структурой, свойствами и происхождением. Полученные данные удалось применить к исследованию ранее неизвестных молекулярных форм фермента, например, глутаминсинтетаз II и III клубеньков желтого люпина.
В работе удалось непосредственно подтвердить биохимические данные о существовании комплекса между двумя растворимыми ферментами: гли-церальдегид-3-фоефатдегидрогеназой и фосфоглицераткиназой. Исследование подобных непрочных комплексов методом электрошюи микроскопии ранее не проводилось.
Практическая значимость. В диссертационной работе сформулированы общие представления и проведено сравнение субъединичной структуры и внутренней симметрии более 20 ферментов различных классов, групп и происхождения, изучено строение одного из ферментных комплексов.
Результаты диссертационной работы могут иметь значение для углубле-Ш1я знаний о структуре и свойствах олигомерных ферментов и представлять интерес для биофизиков и биохимиков, занимающихся проблемами биологической фиксации азота, биоэнергетики и другими.
Методические приемы, разработанные в ходе изучения данных структур, могут оказаться полезными при электронно-микроскопических исследованиях других биологических объектов.
Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертационной работе, докладывались на УІІ Европейском конгрессе по электронной микроскопии (Гаага, 1980); Всесоюзных симпозиумах "Структура биологических макромолекул" (Звенигород, І98Г, 1984; 1986); Всесоюзном симпозиуме "Механизмы усвоения азота и биосинтеза белка в растениях (Алма-ата, 1981); ШСоЕетско-итальянском симпозиуме по макромолекулам в функционирующей клетке (Сиена, Италия, 1982); II Советско-швейцарском симпозиуме по структуре биологических мембран (Ташкент, 1983); УІП Европейской конференции по электронной микроскопии (Будапешт, Венгрия, 1984); 16 конференции ФЕБО (Москва, 1984)," П Международной конференции по электронной микроскопии (Киото, Япония, 1986); XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Звенигород, 1988).
Структура и объем работы. Диссертация-состоит из введения, обзора литературы (4 глэеы), экспериментальной части и обсуждения результатов (5 глав) и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 281 странице машинописного текста, еключэя 89 рисункоЕ-и 6 таблиц. Список цитированной литературы включает 314 названий.