Введение к работе
Актуальность темы.
Проблема укладки полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру является актуальной уже несколько десятилетий и до сих пор, по-видимому, достаточно далека от своего решения. Тем не менее, теория белковых структур развивалась довольно эффективно. В значительной мере это связано с развитием стереохимического анализа белковых структур, опирающегося на идею о существовании так называемых стандартных структур полипептидной цепи или, иначе, супервторичных структур, то есть одинаковых структурных единиц, повторяющихся в различных белках и определяющих основные иерархические модули пространственного ансамбля белковых макромолекул.
В ходе исследования трехмерной структуры белков возникла проблема определения взаимосвязи между структурой и биологической и химической функциями биополимеров, иногда имеющих различные .функции при одинаковой структуре, а иногда строго подчиняющихся закону: структура — функция.
Среди последних долгое время наиболее ярким примером была пространственная организация так называемого кофермент-связывающего домена в НАД-зависимых дегидрогеназах, открытая более двух десятилетий назад. Пространственная организация такого типа явилась, по сути, первым примером супервторичной структуры — укладки Россмана или, иначе, нуклеотид-связывающего домена — структуры, связывающей нуклеотиды, находящиеся в составе различных химических соединений. На сегодня уже имеется достаточное число примеров, когда подобного рода домены имеются в белках, не обладающих ни НАД-, ни нуклеотид-связывающими свойствами, а данная функция может поддерживаться и другой' третичной структурой. Однако вопрос о том, как конкретная структура поддерживает данную функцию, остается нерешенным, правда, на фоне более общей проблемы: соотношения трехмерной структуры белка и активного центра, достаточного для проявления функции.
НАД и НАДФ являются кофакторами большого количества ферментов, которые при всем.многообразии катализируемых ими реакций, имеют ряд консервативных свойств, определяемых природой используемого кофермента. Эта особенность, сочетающаяся с древностью использования живыми организмами молекулы НАД в окислительно-восстановительных реакциях, выделяет эти ферменты как уникальный объект для изучения происхождения и эволюционирования ферментов, использующих сложные кофакторы.
Вторая проблема, важная для понимания механизмов функционирования и структурообразования в мультидоменных ферментах —
проблема регуляции. Она тесно связана с проблемой симметрии доменной и субъединичной организации белков. Наиболее характерные примеры такой организации выявляются при рассмотрении класса дегидрогеназ.
В настоящей работе изучены закономерности структурной организации ряда нуклеотид-связывающих ферментов, в основном НАД-зависимых дегидрогеназ 2-оксикислот, а также на примере формиатдегидрогеназы определены вклады во внутримолекулярные взаимодействия некоторых классических супервторичных структур и новой, найденной нами в D-специфических дегидрогеназах, супервторичной структуры типа а-спираль — укладка Россмана—а-спираль.
НАД-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ) метилотрофных бактерий Pseudomonas sp.101 катализирует последнюю стадию метаболизма метанола — окисление формиата до СОг при сопряженном восстановлении никотинамидадениндинуклеотида НАД в НАД«Н. Проведенные к настоящему времени физико-химические исследования ФДГ показали, что данный фермент является весьма интересным объектом для изучения собственно НАД-зависимого дегидрирования. В отличие от хорошо изученных к настоящему времени дегидрогеназ, ФДГ обладает достаточно простым субстратом, а в катализируемой ферментом реакции отсутствует стадия переноса протона с субстрата на фермент, что позволяет существенно расширить представления о движущих силах реакции. ФДГ обладает нетипичной для большинства дегидрогеназ пространственной организацией субъединицы фермента, когда оба домена субъединицы — каталитический и кофермент-связывающий — имеют одинаковую топологию.
В виду того, что НАД как кофактор работает с огромным числом различных ферментов, все типы стандартных структур, встречающиеся в дегидрогеназах, могут играть важную роль в механизмах структурообразования и каталитических функциях этих ферментов, и, следовательно, исследования супервторичных структур сохраняют свою актуальность.
Цели и задачи исследования.
Исследование внутренней симметрии белковых субьединиц в пространственных структурах D-специфичных дегидрогеназ.
Анализ пространственной гомологии доменов D- и L-специфичных дегидрогеназ на основе выделенного консервативного структурного мотива.
Поиск новых типов супервторичных структур в D-специфичных дегидрогеназах.
Анализ физико-химических свойств формиатдегидрогеназы, определяемых конкретными супервторичными структурами.
Научная новизна работы.
Проведен исчерпывающий анализ распределения конформаций по пространственной структуре формиатдегидрогеназы из Pseudomonas sp. 101. Впервые найдена третья укладка Россмана, расположенная в каталитическом домене, что означает, что каталитический центр ФДГ частично формируется за счет вторичных структур, принадлежащих укладке Россмана. Показано, что в структуре ФДГ имеется дополнительная к двум осям симметрии: оси симметрии второго порядка, связывающей субъедшшцы фермента, и оси псевдосимметрии, связывающей классические укладки Россмана в кофермент-связывающем домене, — ось псевдосимметрии, связывающая между собой домены, принадлежащие к каждой из субъединиц. Поэтому результирующая внутренняя симметрия фермента выглядит как
^-^псевдо-псевдо-
Проведен подробный анализ пространственных гомологии в классе D-специфичных дегидрогеназ. Показано, что внутренняя симметрия, обнаруженная на примере ФДГ, свойственна всем D-специфичным дегидрогеназам. Таким образом, дегидрогеназы 2-оксшшслот разбиваются на два структурно различных класса: D- и L-специфичные дегидрогеназы. Поиск гомологии в дегидрогеназах проведен с использованием нового консервативного структурного мотива на уровне супервторичной структуры, выявленого в НАД-зависимых дегидрогеназах. Пространственные гомологии впервые обнаружены и в каталитических, и в кофермент-связывающих доменах дегидрогеназ, что позволяет классифицировать домены дегидрогеназ в банке структурной классификации белков SCOP на соответствующем уровне доменной организации.
Впервые найден новый тип супервторичной структуры, наблюдающийся во всех D-специфичных дегидрогеназах: а-спираль — укладка Россмана —а-спираль. Эта стандартная структура обнаружена в восьми доменах дегидрогеназ. Новые супервторичные структуры включают в вышеназванных дегидрогеназах классическую супервторичную структуру Россмана.
Проанализирована роль новой супервторичной структуры в свойствах кофермент- и субстрат-связывающих центров ФДГ: примыкающие к укладке Россмана длинные а-спирали создают естественные каналы для недиффузионного дрейфа кофакторов и субстратов в зоны активных центров фермента. Экспериментально установлена роль длинных а-спиралей в пространственной структуре дегидрогеназ.
Практическая значимость работы.
Детальное изучение нового типа пространственной укладки полипептидиых цепей в ряде глобулярных белков может помочь при компьютерных разработках лекарственных препаратов, в том числе для
ингибирования дегидрогеназ и других нуклеотид-связывающих белков, что важно, в частности, при создании новых противораковых препаратов. Этот тип укладки можно использовать в качестве стабильного белкового модуля при белковой инженерии дегидрогеназ и создании химерных белков.
Достоверность результатов.
Все полученные результаты опираются на данные рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением. Поэтому они составляют серьезную основу для оценки полной обоснованности основных научных результатов.
Апробация работы.
Результаты диссертации докладывались на Втором съезде биохимического общества Российской Академии наук, Москва, 19 — 23 мая, 1997г. и на Третьей международной Энгельгардтовской конференции (The Зг international Engelhardt conference on molecular biology, Volga), 9—14 июня, 1997г.
Публикации.
По материалам работы опубликованы три статьи и тезисы. Основные положения, выносимые на защиту:
Внутренняя симметрия в третичных структурах в D-специфичных дегидрогеназах.
Структурная классификация доменов D- и L-специфичных дегидрогеназ на основе пространственной гомологии выделенного консервативного структурного мотива.
Новый ' тип супервторичной структуры в D-специфичных дегидрогеназах и его свойства.
Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 115 страницах и включает 28 рисунков и 13 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 107 наименований. Диссертация состоит из введения, шести глав и заключения.