Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время широкое применение в биологических средствах защиты растений находят 5-эндотоксипы Bacillus thuringiensis, активные в отношении личинок более чем 300 видов насекомых отрядов Lepidoptera, Diptera и Coleoptera. В связи с высокой избирательностью действия 5-эндотоксинов для поражения всего спектра насекомых-вредителей требуется использование большего их разнообразия. Поэтому усилия многих исследовательских групп направлены на поиск новых 5-эндотоксинов, обладающих ранее неизвестным типом специфичности. На данный момент клонированы и секвенированы гены более чем 80 различных 5-эндотоксинов. Тем не менее, поиск новых 5-эндотоксинов и их генов остается актуальной задачей. Кроме того механизмы экспрессии 5-эндотоксинов их возможная взаиморегуляция а также происхождение изучены недостаточно Поэтому модель генов 5-эндотоксинов является перспективной с точки зрения изучения регуляции экспрессии генов у неположительных микроорганизмов в ходе споруляции, а также эволюции их генома. Изучение механизмов экспрессии генов 6-эндотоксинов в особенности в штаммах с множественными генами, к которым относится выбранный нами штамм подвида galleriae, не только представляет научный интерес, но может также служить базой при создании новых высокоэффективных штаммов-продуцентов 5-эндотоксинов для сельского хозяйства.
Целью работы являлось клонирование и структурно-функциональная характеристика геномного локуса Bacillus thuringiensis подвида galleriae 11167, содержащего новый ген 5-эндотоксина и изучение его белкового продукта, а также изучение возможности использования мини-гена устойчивости к эритромицину в качестве прямого транскрипционного репортера при создании продуцентов на базе В. thuringiensis и широкого круга других микроорганизмов.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В ходе проведенной работы разработан методический подход к скринингу геномных банков В. thuringiensis, основанный на использовании вырожденных праймеров для получения гибридизационного зонда на основе наиболее консервативного участка генов cry. За счет использования этого подхода клонирован и охарактеризован геномный локус содержащий природно неэкспрессируюшийся ген 5-эндотоксина crylGal, значительно отГчающшїся от „звестньк ранееТенов по последовательности Общая длина секвенировшпюТобласти оставила 7 т п н Проведена гетепологичная экспрессия кл1,РОванЗгеГв
кликах В 2"»
отсутствии "стресс,," Е\т^^и^^^ш^ш^Тсч^7^^ия
и гетГмноГокру^е.ше результате
Доказана высокая устойчивость белка Cry 1 Gall полученного в природно акристаллнческом штамме В. thuringiensis к протеолнзу трипсином, что с одной стороны, доказывает нативиость его пространственной структуры, с другой - является необычным
признаком для большинства кристаллических белков В. Ihuringiensis, под действием трипсина превращающихся в зрелые активные истинные токсины.
Проведены биотесты полученного белка-эндотксина Cry1Gal в отношении сосновой шагающей гусеницы Т. pytiocampa. Обнаружена умеренная яоксичность ьелка а отношении этого экономически значимого вредителя леса. В ходе анализа 5"-фланкирующей части гена crylGal была найдена последовательность, подобная промотору транскрипции ВТП-типа. Наличие только одного споруляционного промотора ВТИ-типа Danee не показано для генов б-энлотоксинов и обнаружено впервые Обнаружено отсугстГие ТромоГра В^Г отве^^ного Гпрії суперэ^прессию 6-эндо^Гнов обуслаЗает агсугствиГГГног^бел^вого n^ZZ 7в ^^ ^моторі нищимся вГс^е^льтикопиШюй^б^и^рной пл^миды. СбСГВЄНН0Г
Недавно в работах кафедры генетики Иллинойского универсіггета под
руководством профессора Манькина был постулирован новый механизм обеспечения
устойчивости к макролидным антибиотикам за счет транскрипции и трансляции 15-ти
нуклеотидной открытой рамки считывания, находящейся в составе природной 23S рРИК
Kcoli. Дальнейшие исследования показали, что некоторые синтетические мини-гены,
кодирующие тетра-, пснта- и гексапептиды способны придавать устойчивость к
макролидным антибиотикам клеткам Кcoli На основании анализа набора
последовательностей, обладающих згой способностью полученных в результате
скрининга экспрессионного банка синтетических олигонуклеотидов была выведена
консенсус-последовательность обеспечивающая наибольшую степень защиты от
антибиотика Исследования поведения транскригггов м.ши-reZ, в системах трансляции ш
vitro пшвГлили выдвинуть модель ТбДоГого ершТобъяшяющуТ Манизм
юаимодЫ^тГя эти^с мРНК с ScoMTTv^^^v^Z^xZn удТеш.ё 7Гйб"ка рноосомои, результате которого происходи удаление
Ранее не было получено доказательств возможности функционирования Е-псптидов
в клетках бацилл, эволюционко удаленных от К coli. В настоящей работе мини-ген был
впервые использован в качестве транскрипционного репортера (Рис. 4). В рамках
характеристики мини-гена наряду с геном crylGal был использован ген
глутамилэндопептидазы В. licheniformis (gsehli). Это дало возможность, в частности,
существенно улучшить продуктивность низкоэффективных штаммов продуцирующих
глутам1ШэндопептидазуВ.л2/0т,У ,
Публикация и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и 1 находится в печати. Результаты работы представлены на V Научной Конференции ГосНИИгенетика (Москва, Россия, 1997 г.) и Международном Симпозиуме Molecular responses of plants to biotic and abiotic stresses.(XeflbCHHKn, Финляндия, 1997).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, посвященного, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (ссылок). Диссертация содержит 25 рисунков и 7 таблиц. Полный объем работы 120 страниц.