Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших реакций фотосинтеза івляется окисление вода. Эту функцию осуществляет фотосистема 2 'ЗС 2/. Хлорофилл реакционного центра $С 2 /Р6Є0/, перейдя под іействием света в синглетно возбужденное состояние, передает свой ілектрон по цепи переносчиков пластохинону и восполняет его поте-)ю, окисляя переносчикz , который акцептирует электрон от систе-ы разложения вода. Появление методик получения фотохимически ак-ивных препаратов ФС 2 предопределило большой успех в исследова-ии её структурно-функциональной организации. Наиболее очищенный омплекс $С 2, осуществляющий разделение зарядов меуду Р6С0 и пер-ичным донором электронов феофитином, состоит из трех полипепти-ов с молекулярными массами 32/D1/, 34/D2/ и 9/цитохром в-559/кДа Nanba,Satoh, 1987/. Существуют методики выделения пигмент-белко-лс комплексов SC 2, способных восстанавливать ДХ2МФ в присутст-та ДФК, которые помимо перечисленных полипептидов включают один -7 кДа /Yamaguahi et.al.,I9F8/ или два - 47 и 43 кда / Satoh et. al., Э83/ белка. Ханотакисом с сотрудниками /Ghanotakis et.al.,I9E7/ іл выделен наименьший по числу входящих в него полипептидов ком-іекс, сохраняющий в присутствии Mn , СІ и Car функцию выделения іслорода, состоящий из белков 47,43,32,30,9 и 33/периферическо->/ кДа. Препараты ФС 2, способные выделять кислород в условиях, 'Иближенных к физиологическим, помимо периферического полипепти-33 кДа содержат периферические полипептиды с молекулярными ссами 16 и 24 кДа /Dunahay et.al.,1984/. Помимо белков, пигмен-в и пластохинонов в состав ФС 2 входят ионы №2+, С1"и Fe"+.
Несмотря на значительные успехи в исследовании ФС 2, многие пекты её структурно-функциональной организации остаются ещё не жененными. К началу исследований, представленных в данной рабо-, появились данные, предполагающие участие кальция в $ункционм-
2+
ровании $G 2. Было установлено, что введение Са стимулирует
процесс фотоактивации системы разложения воды хлоропластов, выделенных из растений, которые выращивались в темноте /Oku et al., 1983/ или при прерывистом освещении /Ono,Inoue, 1983/- Барр с соавторами /Barr et al.,1980/ наблюдали уменьшение скорости переноса электронов через Ж! 2 в'хлоропластах, обработанных хелатором кальция ЭГТА. Этими же авторами /Barr et al.,1982/ позднее было показано подавление фотопереноса электронов в хлоропластах на уровне $С 2 антагонистами кальмодулина трифторперазином и хлорпро-казином.
о.
В связи с возможностью участия Са в функционировании $С 2 представляет интерес исследование влияния на фотоиндуцированный перенос электронов в хлоропластах различных соединений, воздействующих на опосредованные кальцием процессы в других биологических системах. В этой связи наше внимание привлекли локальные анестетики прокаинового ряда. Данные соединения, известные по своей способности блокировать проведение возбуждения по нервному волокну, влияют на многие процессы, протекающие в других мембранных системах. В целом ряде случаев их воздействие на биологические функции связывают с влиянием на опосредованные кальцием реакции или Са^-связывающие компоненты /Volpl et al.f 1979/. Особое значение с позиции привлечения локальных анестетиков к изучению проблемы
роли кальция в функционировании $С 2 приобретает известное из ли-
р. тературных данных свойство указанных соединений вытеснять Са из
модельных /Hauaer,Dawaon,1968 / и нативных /Low et al., 1979/мембран Кроме того, накопленный к настоящему времени значительный экспериментальный материал, касающийся взаимодействия местных анестетиков с искусственными и природными мембранами,может быть использован при изучении их воздействия на фотобиологические процессы.
Цель и задачи работы. Целью работы явилось изучение влияния гюкальных анестетиков прокаинового ряда на хлоропласти. При этом 5ыли поставленн конкретные задачи; исследовать воздействие данных зоединений на фотоперенос электронов в хлоропластах, рассмотреть влияние условий эксперимента на характер взаимодействия локальных анестетиков с тилакоидными мембранами; изучить действие этих соединений на характеристики SC 2 хлоропластов; исследовать влияние тональных анестетиков на содержащийся в хлоропластах кальций.
Научная новизна работы. В работе впервые исследовано действие юкальных анестетиков прокаинового ряда на хлоропласти. Сбнаруже-jo, что данные соединения подавляют выделение хлоропластами кисло-зода, причем эффективность их ингибирующего действия, коррелирует t анестезирующее активностью. Установлено, что локальные анесте-'ики прерывают фотоперенос электронов в первую очередь на донор-юм участке С 2. Обнаружено, что заряженные локальные анестетики і концентрациях, значительно меньших ингибирующих, оказывают разоб-(ающее действие на электронный транспорт. Показано, что степень інгибирования заряженными локальными анестетиками фотопереноса лектронов возрастает при повышении рН суспензии хлоропластов, :то обусловлено увеличениемсодержания анестетика в мембране пслед-твие его депротонирования и перехода в нейтральную fopi-y. Уста-овлено, что инактивация локальными анестетиками процесса восста-овления хлоропластами 2,6-дихлорфенолиндо.фенола /уУШ№/ коррели-ует с уменьшением выхода переменной флуоресценции хлоропластов. дновременно с ингибированием локальным анестетиком дикаином и нтагонистом кальмодулина хлорпромазином электронтранспортной ак-ивности хлоропластов наблюдается уменьшение амплитуды сигнала ПР 11а. Показано, что инактивация локальными анестетиками пере-оса электронов сопровождается выходом кальция из тилакоидных змбран.
В результате проведенных в работе исследованю" обнаружен новый класс ингибиторов донорного участка 5й 2 - локальные анестетики прокаинового ряда, рассмотрены особенности взаимодействия данных соединений .с тилакоидныки мембранами.
Практическая значимость работы. Обнаружен и исследован ношР класс ингибиторов фотоиндуцированного переноса электронов - локальные анестетики прокаинового ряда, прерывающие поток электронов на донорном участке С 2. Эти соединения могут наСти применение ? экспериментах, направленных на изучение организации цепи йотопереноса электронов.
В виду показанного в настоящее работе соответствия эффективности ингибирования локальными анестетиками йотопереноса электронов их анестезирующей активности, полученные нами данные, касающиеся влияния этих соединение на тилакоидные мембраны, представляют интерес для выяснения общих закономерностей взаимодействия локальных анестетиков с биологическими мембранами.
В связи с продемонстрированным в данной работе специфическим действием локальных анестетиков на хлоропласти, заключающемся в вытеснении кальция из мембран тилакоидов, уназанные соединения могут найти применение для воздействия на кальций-связывающие участки мембран хлоропластов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ, на I? научной конференции молодых ученых МГУ, Москва, 1966 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано Є печатных работ.
Структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части /объекты и методы исследования, результаты и обсуждение/, выводов, списка цитируемой литературы.
Во введении рассматривается актуальность теш, определяются задачи исследования.