Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопроо о механизме энергетического сопряжения в процессе фотофосфорилирования находится в центре биологических исследований последних лет. Наиболее актуальной является проблема путей переноса протонов между электронтранспортной цепью И АТР -синтетазой. В ряде лабораторий (Theg,Homann, 1982, Dllley, 1981,1982) было показано , что в мембранах тилакоидов существуют домены ионогешшх групп, способных связывать протоны так, что образующийся протонный пул не находится в равновесии с протонами водной фазы. Выход протонов из этих доменов резко ускоряется при световой энергизации мембраны или при добавлении протонофорных разобщителей. Эти данные, а также результаты опытов по предстационарной кинетике фотофосфорилирования (Dtiley, 1987) указывают на важную роль протонных доменов в мехшшзме сопряжения. В то же время вопроо о отроении доменов и механизмах переноса протонов между доменами и ферментными системами, участвующими в фотофосфорилированш,остается открытым. Можно полагать, что в основе этих процессов лежат значительные конформационные перестройки в мембранах хлоропластов.
Цель работы. В работе ставилась задача разработки методических подходов к изучению конформационных переходов в мембранах хлоро-пластоя, связанных с фотофосфорилированием, на основе метода протон - тритиевого обмена. Необходимо было выявить фракцию'мембранно-
Принятые сокращения: авр - аденозин - 5» - дифосфат; АТР - аденозин - 5 - трифосфат; CTj - каталитический компонент АТРазы хлоропластов; СГ0 - мембранный компонент АТРазы хлоропластові ДЦКД -- N.NT- дициклог9ксилкарбодаимвд;ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; мКи'- миликюри (10 расл/мин); мкКи - микрокюри (10 расп/мин){ расп/мин - распад в минуту; хл - хлорофилл; ДДС-Na - додецилсуль-фат натрия.
-связанного трития, свойства которой зависели бы от функционального состояния мембраны. Особый интерес представляло выяснение возможностей прямого взаимодействия компонентов мембраны о АТР-синте-тазой в ходе фотбфосфоршшрования.
Научная новизна габотн. Впервые обнаружено, что при длительной инкубации хлоропластов в среде,содержащей Т20, образуется пул трития, прочносвязаниого с мембраной. Показано, что выход трития из этого пула резко ускоряется при световой энергизации или при добавлении протонофора - грамицидина. Установлено, что в условиях фо-тофосфорилированмя происходит перенос трития из мембранного пула в каталитический компонент АТР-синтетазы (C3?j), причем этот процесс не включает стадии выхода трития в водную фазу. Исследование обнаруженного эффекта показало, что для переноса трития необходимы как энергизация мембраны светом, так и функционирование АТР-синтетазы, Таким образом, впервые получены доказательства существования непосредственных контактов между CTj и такиїли компонентами мембршш хлоропластов, которые участвуют в процессе переноса протонов при фото-фосфорилировании.
Практическое значение работы. Разработанные методические подходы открывают новые возможности для изучения конформационных переходов в биологических мембранах. Использование метода протон - три-тиевого обмена позволяет выявить участие различных ферментных комплексов, таких, например, как АТР-синтетаза, в подобных переходах. Метод позволяет исследовать мембранные препараты в широком диапазоне условий и при различных воздействиях. Предлогаемый в работе мето-дичеокий подход позволяет исследовать взаимодействие протонов с мембраной и её отдельными компонентами, что оообенно важно для изучения функционирования сопрягающих мембран.
- 2.-
Апробация юботц, Результаты исследований докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные' механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущино,1986), Всесоюзном совещании "Энергетичео-кие аспекты клеточного метаболизме" (Пущино, 1988), Международном симпозиуме "Молекулярная организация биологических структур" (Москва, 1989).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура- диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературыі описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения,выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и фотографиями,9'таблицами.