Введение к работе
Актуальность проблемі. Одной из задач, стоящих перед методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в структурных исследованиях биологических макромолекул является поиск подходов к изучению структуры все более и более крупных белков. Пр'движение по этому пути сопряжено с решением большого количества технических, теоретических и практических задач.
Характерной ситуацией является далеко не полное использование информации, содержащейся в спектрах ЯМР (особенно количественной информации) или, наоборот, невозможность получить информацию из-за перекрывания сигналов в спектрах. Для мембранных белков эти и множество других проблем дополняются необходимостью подбора среды, моделирующей мембранное окружение, но отличающуюся от мембраны тем, что позволяет применять всю мощь современных методик ЯМР высокого разрешения.
В настоящей работе представлены результаты развития подходов к решению вышеперечисленных проблем на примере бактериородопсина (БР) и его химотриптического фрагмента сг.
Бактериородопсин - основной белок пурпурных мембран
ГаЛОфИЛЬНЫХ МИКрООргаНИЗМОВ Halobacterium haloblum, СОСТОЯЩИЙ ИЗ
полипептилной цепи длиною 248 аминокислотных остатков и хромофора ретиналя, связьнног; альдиминной связью с остатком Lys216. Поглощение света хромофором запускает фотоцикл, который приводит к переносу протона через клеточную мембрану.
Исследование структуры бактериородопсина методом ЯМР представляет интерес как с точки зрения изучения механизма мембранного транспорта, так и с точки зрения разработки подходов к установлению структуры мембранных белков методом ЯМР.
Данная работа представляет часть проводимых в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и П.А.Овчинникова РАН исследований структуры и функционирования бактериородопсина.
Цель работы, і) Разработка подходов к использованию количественной информации, содержащейся в спектрах ядерного эффекта Оверхаузера (nofsy) белков, для установления х пространственной структуры. 2) Разработка методики измерения времен спин-решеточной релаксации индивидуальных -"ротонов
макромолекул, использущей преимущества двумерных методов ЯМР. э) Поиск среды для солюбилизации бактериородопсина и его фрагментов,, моделирующей мембранна окрукение и позволящей использовать .;етодики ЯМР высокого разрешения. Подбор протокола выде.' эния и солюбилизации фрагментов бактериородопсина, сохраняющего структуру, близкую к нативной. 4) Исследование пространственной структуры фрагмента (1-7і) бактериородопсина методами ЯМР.
Научная новизна и практическая значимость работы. На основании детального анализа Фзкторов, влияющих на объемы сигналов протонов в двумерных спектрах ядерного эффекта Оверхауэера (ЯЭО), предложена методика определения локальной структуры полипептидной цепи с использованием матрицы релаксации дипептидази единицы. Данный подход нашел применение и продолжает использоваться при расчете пространственной структуры пептидов и бетаов по данным ЯЭО.
Впервые предложена методика измерения времен спин-решеточной релаксации индивидуальных протонов и метальных групп сложных биологических макромолекул. Экспериментально показана применимость предложенной методики к детальным структурным исследовае:ям макромолекул.
Показано, что, будучи солюбилизированным в смеси хлороформ/метанол (і:і), о,і и ысю4, бактериородопсин обладает компактной пространственной структурой, а фрагменты бактериородопсина сохраняют свою вторичную структуру. Методой 'н-ЯМР изучена пространственная структура химотриптического фрагмента сг бактериородопсина (остатки і-71 в первичной последовательности).
Апробация работ и публикации. Основные результата диссертационной работы доложены и обсуждены на "їх летней школв Ампера" СХСР, Новосибирск, 1987), "vii Всесоюзном симпозиуме пс химии белков и пептидов" (СССР, Таллин, 1987), "V МеждународноЕ конференции по ретиналь-содержащим белкам" (Франция, Дурдан, 1992), "xv Международной конференции по магнитному резонансу і биологических системах" (Израиль, Иерусалим, 1992) и др.
По материалам диссертации опубликовано ? работ во всесоюзны? и международных изданиях.
Сбъел и структура работы. Диссертационная работа изложена не
213 страницах, содержит * таблицы и 57 рисунков.
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав, экспериментальной части и выводов. Библиографа-; включает 1вэ наименований.