Введение к работе
- З -
Актуальность проблемы. Эстрогенная индукция вителлогенеза печени петушков хорошо охарактеризована на генетическом уровне. Сравнительно меньше, однако, известно о ядерных событиях, ассоциированных с ответом и включающих широкомасштабные структурные изменения хроматина. Особый интерес представляет вопрос о взаимодействии гормон-рецепторных комплексов с акцепторными участками хроматина, в структуре которых важная роль принадлежит не-гистоковым белкам, обеспечивающим зысокуго специфичность взаимо-v действия.
В настоящее время известно, что функционирование хроматина решающим образом зависит от характера взаимодействия входящих в его состав компонентов, определяющего в конечном счете упаковку, генетического материала. Вместе с тем, недостаточно изучен вопрос о природе связей негистоновых белков хроматина с ДНК, гис-тонами и друг с другом, и об изменении типа взаимодействий их со структурой хроматина при генной активации. Эти белки чрезвычайно гетерогенна по составу и свойствам, выполняют структурные, каталитические, регуляторные функций и являются наименее изученными. Трудности етруктурно-функционатъкого исследования белков хроматина являются препятствием для дальнейшего продвижения исследований структуры хроматина при различных специфических воздействиях, включая гормональные. Поэтому, предотавляется актуальным разработка нового методического подхода для выяснения типов взаимодействий, определяющих положение белков в структуре хроматина, изучения изменения их взаимного расположения при гормональном воздействии.
Такую, качественно новую информацию о негистоновых белках хроматина дает предложенный в работе метод двухкоординатной экстракции, результаты которого имеют графически наглядное представление и легко подвергаются компьютерному анализу.
Цель и задачи исследования,. Целью настоящего исследования было изучение как традиционными методами, так и новым методическим подходом (методом двухкоординатной экстракции) изменения ассоциации негистоновых белков хроматина с областями генома при воздействии стероидных гормонов.
В работе были поставлены следующие задачи:
I) выявить характерные для воздействия эстрадиола-Г7в
- 4 -структурные сдвиги в хроматине и его фракциях,
-
выяснить роль негистоновых белков хроматина в акцепции гормонального сигнала,
-
применить разработанный новый методический подход для изучения структурированности белков хроматина,
-
изучить статус негистоновых белков хроматина в контроле и после воздействия стероидными гормонами методом двухкоор-динатной экстракции,
-
изучить влияние структурных перестроек хроматина на положение негистоновых белков.
Научная новизна работы. С использованием метода термической денатурации выявлены характерные структурные сдвиги в хроматине при эстрадиоловом воздействии. В составе кислых негистоновых белков обнаружены етероид-чувствительные фракции. Связывание стероид-рецепторных комплексов зависит не только от состава негистоновых белков, но и от их взаимного расположения в структуре хроматина.
Новый метод изучения белков в составе надмолекулярных комплексов позволил получить качественно новую информацию о бачках хроматина в структурно-функциональном плане. Проведена классификация негистоновых белков по типу экстрагируемости, выявлены типы взаимодействий, определяющие положение белка в структуре с помощью ряда новых физико-химических параметров. Составлены таблицы-диаграммы с линиями полувыхода для исследуемых белков как контрольных, так и опытных образцов в системах экстракции ЫаС1 -мочевина, NaCI-pH. Совокупность линий полувыхода анализируемых белков в обеих системах экстракции является специфической и индивидуальной характеристикой для каждого из них. Метод фиксирует специфические изменения в характере выхода отдельных белков из хроматина гормон-обработанкых животных с помощью анализа поверхностей экстракции и диаграмм экстрагируемости этих белков, а также выявляет сдвиги в сродстве белков к хроматину.
Практическая ценность работы. Полученные в работе данные позволяют углубить представления о физико-химических особенностях хроматина, конкретизировать известные модели структурно-функциональных белок-белок и белок-ДНК взаимодействий, предложить качественно новые параметры для сравнительного исследования белков хроматика при гормональных взаимодействиях.
Метод "даухкоординатной экстракции", использованный' б рабо-
те для изучения структурированности белков хроматина печени петушков при стероидном воздействии, может быть применен также для изучения сдвигов статуса как отдельных белков, так и их совокупности в составе других сложных макромолекулярных структур (мембрана, рибосома).
Апробация -работы. Материалы диссертации были представлены на III Республиканской научной конференции по вопросам биофизики (Ереван, 1982), УШ Всесоюзном симпозиуме по структуре и функциям клеточного ядра (Лущино, 1984), II Республиканской конференции, посвященной проблемам физико-химической биологии (Ереван, 1986), IX Всесоюзном симпозиуме по структуре .и функциям клеточного ядра (Черноголовка, 1987), III конференции молодых ученых Института экспериментальной биологии АН Арм.ССР (Дилижан,. 1988), Международном конгрессе биохимиков (Прага, 1988г.). Работа апробирована на заседании ученого совета Института молекулярной биологии АН РА от 13 декабря 1991 года и на заседании кафедры биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета от 17 декабря 1991 года.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, трех глав (I - обзор литературы, II - объект и методы исследований, III - результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 128 страницах машинописного текста.