Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время сущестует гипотеза, согласно которой липопротэинам (ЛП), модифицированным в результате перекисного окисления липидов (ПОЛ), отводится важная роль в развитии атеросклероза. Одна из вероятных причин образования окисленных ЛП в крови - взаимодействие нативных ЛП с активными формами кислорода (/>. НО, ОН," НОСІ/ОСТ ), генерируемыми нейтрофилами и моноцитами-макрофагами при их активации. Исследованиями последних лет установлено, что О , НО сами по себе являются мало эффективными окислителями липидов. Результаты работ ряда авторов дают основание полагать, что ОН', образующийся при взаимодействии этих продуктов с ионами металлов переменной валентности, не принимает участия в реакции окисления ЛП фагоцитами (Panasanko с соавт., 1991; Hiramatsu с соавт., 1987). В этом случае можно предположить, что окислительная модификация ЛП осуществляется в результате взаимодействия последних с хлорноватистой кислотой (НОС!) или ее ионизированной формой - гипохлорит-анионом (ОСІ ). Н0СІ/0С1 образуется в реакции, катализируемой ферментом нейтрофипов и моноцитов миелопероксидаэой (МПО) и является сильным окислителем. На образование НОС]/ОСІ затрачивается не менее- 28% количества О , потребляемого ней-трофипами при активации (Foote с соавт., 1983). Установлено, что субстратом МПО наряду с НО может служить О , при этом образуется все тот же гипохлорит (Cuperus с соавт., 1.986). МПО способна встраиваться в липидную фазу белок-липидных комплексов и гам катализировать образование НОСІ/ОСІ . Каталитически активная миелопероксидаза была обнаружена в местах атеросклеротического повреждения сосудов человека (Daugherty с соавт., 1994). Если к этому добавить, что НОС1/ОС1 способен модифицировать антиоксиданты, входящие в состав ЛП ((Х-токоферол, {3-каротин, ликопин) (Hazel 1 с соавт., 1993), а также ряд белков, обладающих антиоксидантной функцией (церулоплазмин, трансферрин, суперок-сиддисмутаэу, каталаау) (Говорова с соавт., (939; Aruonia с соавт., 1987), то становится ясно, что гипохлорит может играть ключевую роль в окислительной модификации ЛП in vivo.
Актуальность данной темы связана также с тем, что в последнее
)
время гипохлорит используется внутривенно в качестве бактерицидного и детоксицирующего агента при перитонитах, остром панкреатите, тяжелых ожогах и отравлениях. Для оптимизации применения метода непрямого электрохимического окисления крови в клинике необходимо всестороннее исследование взаимодействия гипохлорита с белок-липидными комплексами крови.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение способности гипохлорита, добавленного извне и образующегося при миело-лероксидаэном катализе, окислять липиды ЛП и исследование влияния гипохлорита на физико-химические свойства ЛП. Основные задачи исследования:
1. Выяснить, способен ли экзогенный и образующийся в системе
"МПО+Н О +С1 " гипохлорит окислять липиды разных классов ЛП.
2. Исследуя методом спиновых зондов взаимодействие гипохлорита с
донорами электронов, локализованными в липиднои фазе, изучить
способность гипохлорита проникать в липидную фазу ЛП.
2+
3. Методом хемилюминесценции (ХЛ) исследовать роль ионов Fe в гипо-
хлорит-индуцироаанном окислении липидое.
2+
4. Используя ионы Мп в качестве спинового зонда, а также методом
электрофореза исследовать влияние Н0С1/0С1 на электрический заряд поверхности частиц липопротеинов низкой плотности (ЛНП).
5. Методом спиновых зондов и меток изучить структурные изменения по
верхностного протеояипидного слоя ЛНП под действием гипохлорита. Выяс
нить, будут ли таковые приводить к нарушению взаимодействия ЛНП с
клетками (на примере эритроцитов и нейтрофилов).
Научная новизна. С использованием слинмеченых жирных кислот впервые удалось продемонстрировать способность гипохлорита проникать в поверхностный протеолипидный слой ЛНП. Методом спиновых зондов и меток выявлены изменения физико-химических свойств белковой и липиднои фаз ЛНП под действием гипохлорита.
Впервые установлено, что гипохлорит, добавленный извне и образующийся в системе "МПО+Н О +С1 ", инициирует процессы ПОЛ в ЛП всех классов, протекающие с участием свободных радикалов и сопровождающиеся образованием первичных (пероксидной природы), вторичных (альдегидной
природы, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой -ТБК) и конечных (шиф-
2+
фовых оснований) продуктов ПОЛ. Методом ХЛ изучена роль Fe в гипо-
хпорит-индуцированном ПОЛ на стадиях инициирования и разветвления цепей .
Проведенное систематическое сравнительное исследование влияния НОСІ/ОСІ на разные классы ЛП (ЛНП, ЛП очень низкой плотности - ЛОНП, ЛП высокой плотности - Л8П) показало, что обусловленное гипохлоритом изменение электрофоретической подвижности разных классов ЛП качественно совпадает с их способностью окисляться под действием НОСІ/ОСІ и уменьшается в последовательности: ЛОНП > ЛНП > ЛВП.
Показано, что модификация ЛНП гипохлоритом приводит к усилению их холестерин-донорной способности при нерецепторном, неопосредованном эндоцитозом обмене холестерина с мембранами эритроцитов. Предварительно инкубированные с гипохлоритом ЛНП активируют нейтрофилы, что может способствовать усилению процессов ПОЛ в ЛП.
Практическое_значение работы. Результаты данной работы вносят вклад в развитие теории атерогенеэа, разработку средств профилактики и лечения этого заболевания, а также позволят оптимизировать применение гипохлорита в методе непрямого электрохимического окисления крови, практикуемого при тяжелой интоксикации организма.
Апробация_работы. Результаты работы были представлены на 1-ой Всесоюзной конференции "Электрохимические методы в медицине" (Сочи, 1991), Международной конференции "Активные формы кислорода в химии, биологии, медицине" (Санкт-Петербург, 1991), 10-ой Всесоюзной конференции "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Минск, 1992), Международной конференции "Свободные радикалы в химии, биохимии и медицине. Критические аспекты." (Austria, Vienna, 1993), научных конференциях НИИ ФХМ МЗ РСФСР.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Структура_и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, описания результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов. Библиографический указатель содержит 187 наименований. В диссертации содержится 39 рисунков и 1 таблица.