Введение к работе
1.1 Актуальность работы. Созревание глобулярных белков в клетке обусловлено двумя основными процессами: биохимическим -' синтезом аминокислотной последовательности, осуществляемым рибосомой с участием белок-синтезирующэго аппарата клетки, и физическим - приобретением белковой молекулы функциональной пространственной организации. Вопрос каким образом белки сворачиваются в функционально активную пространственную структуру является одним из основных в физике белка с тех пор как была установлена первая пространственная структура глобулярного белка/ Открытие того, что зрелый функционально активный белок может приобретать свою исходную пространственную структуру вне клетки (в отсутствие клеточных факторов) после того как он был предварительно развернут денатурирующими агентами, привело к центральной гипотезе о тон, что вся необходимая и достаточная информация о пространственной организации белка закодирована в его первичной структуре (аминокислотной последовательности) и сделало возможным экспериментально изучать процесс сворачивания белков прямыми структурными методами. Оценка вероятности того, что белок сворачивается путем беспорядочного перебора всех возможных конформаций полипептидной цепи дала астрономически большое время, что противоречило реальности (парадокс Левинталя). Это обстоятельство привело к другой важной гипотезе о том, что должен существовать путь сворачивания (определенная последовательность событий), общий для всех глобулярных белков. В то же время, данные по рентгеноструктурному анализу пространственной структуры большого количества глобулярных белков указывали на их общие структурные характеристики. Так' все глобулярные белки содержат большое количество элементов вторичной структуры (ос-спирали и (3-листы), на одной стороне которых обычно находятся скопления гидрофобных боковых групп (гидрофобные кластеры). Гидрофобные кластеры образуют гидрофобное ядро молекулы белка, которое обеспечивает глобулярность и фиксацию элементов вторичной структуры друг относительно друга в пространстве (так называемую "топологию" укладки или третичную пространственную структуру полипептидной цепочки). Наконец, ферментативные функции белковой молекулы и ее устойчивость к
изменяющимся условиям внешней среды обеспечиваются жесткой фиксацией большинства белковых групп. При этом формируется конфигурация активных центров белков, а гидрофобное ядро экранируется гидрофильными белковыми группами, обеспечивая тем самый растворимость обычных (не мембранных) глобулярных белков в водной среде. Наличие определенной иерархии структурной организации белковой молекулы, обшей для всех глобулярных белков, наводит на кысль, что существует определенная последовательность событий, определяющая путь ее самоорганизации. Экспериментальное исследование самоорганизации белка включает два основных подхода: равновесный и кинетический. Равновесный подход заключается в том, чтобы "выключать" часть внутримолекулярных взаимодействий, поддерживающих натхвную структуру белка, и анализировать конформационное состояние, которое при этом реализуется. Такое "выключение" части внутримолекулярных взаимодействий достигается постепенным изменением внешних условий (состава растворителя, температуры, рН среды и т.д.). Кинетический подход заключается в том, что внешние условия, в которых белковая молекула находится в полностью развернутом состоянии (например, высокие концентрации сильных денатурантов, таких как мочевина или гуанкдингидрохлорид), резко (скачком) изменяются на условия, в которых белковая молекула находится в нативном (биологически активном) состоянии (например, низкие концентрации денатурантов), а за формированием пространственной структуры белка следят во времени. Используя равновесный подход, исследователи довольно быстро обратили внимание на то, что на пути разворачивания (денатурации) белковых молекул часто накапливаются конформационные состояния, промежуточные между нативнык и полностью развернутым. Такие промежуточные конформационные состояния получили название "частично свернутых". Однако, всестороннее исследование основных структурных характеристик, равновесных промежуточных конформационных состояний глобулярных белков продолжается по настоящее время и, в значительной части, является составом настоящей работы. Развитие кинетических исследований в существенной степени сдерживалось отсутствием хорошо разработанных экспериментальных подходов, позволяющих следить за быстрым изменением основных структурных характеристик белковой молекулы в процессе ее сворачивания. Особенно это
касалось методов, чувствительных к формированию гидрофобных кластеров и глобулярности белковой цепи.
В настоящей работе разработаны и успешно использованы четыре методических подхода, позволяющих следить за формированием гидрофобных кластеров и глобулярности белковой цепи в субсекундном временном интервале, что в значительной степени стимулировало кинетические исследования процесса самоорганизации белков. Используя как разработанные так и ранее известные методические подходы, в работе был исследован процесс самоорганизации более десяти глобулярных белков, выявлены и структурно охарактеризованы как равновесные так и кинетические общие промежуточные состояния, накапливающиеся на пути их сворачивания. Важным вопросом является соответствие процесса самоорганизации белка in vitro с процессом его сворачивания в клетке (in vivo). В частности, в последнее время широкое внимание привлек особый класс белков теплового шока - так называемые молекулярные шапероны. Как было установлено, эти белки принимают непосредственное участие в процессах сворачивания и внутриклеточного транспорта вновь синтезированных белковых цепей. В работе исследовано влияние на процесс самоорганизации глобулярных белков одного из представителей молекулярных шаперонов - белка GroEL из Е. Coli. Показано, что взаимодействие GroEL с ранними кинетическими промежуточными состояниями на пути сворачивания белков не ускоряет, а наоборот замедляет приобретение сворачивающийся белком окончательной нативной структуры. Единственным, физически оправданным объяснением участия GroEL в сворачивании белков в клетке является то, что взаимодействуя с ненативными конформациями белков, он предотвращает их от неспецифической ассоциации, которая является "фатальной" для дальнейшего сворачивания в нативную^труктуру.
1.2 Цель и задача исследования. Цель настоящей работы состояла в том, чтобы экспериментально установить последовательность основных событий, которые формируют пространственную структуру глобулярного белка из полностью развернутого состояния, т. е. "грубый" путь самоорганизации белковой цепи, закодированный в ее аминокислотной последовательности.
При этом решались следующие задачи:
- разработка методических подходов, позволяющих следить за
формированием основных структурных характеристик глобулярного белка ( вторичной структуры, гидрофобных кластеров, глобулярности и жесткости третичной структуры ) как в равновесии так и во времени;
- мультипараметрическое исследование процесса самоорганизации
основных классов мономерных глобулярных белков (а-спиральных и
/3-структурных, имеющих и неимеющих интактные дисульфидные связи,
одно и мультидоменных ) с целью выявления общих закономерностей;
выявление и структурная характеристика основных промежуточных конформационных состояний белковой цепи, накапливающихся на пути ее самоорганизации;
установление природы факторов, лимитирующих скорость сворачивания глобулярных белков;
- влияние на процесс сворачивания глобулярных белков таких
клеточных факторов как молекулярные шапероны.
1.3 Научное значение и новизна работы определяется тем, что: впервые представлены наиболее полные, экспериментально обоснованные данные о процессе самоорганизации целого ряда мономерных глобулярных белков, на основании которых установлена последовательность основных общих событий, формирующих пространственную структуру белка из полностью развернутого состояния. Показано, что эта последовательность событий иницируется полным или частичным формированием элементов вторичной структуры (а-спиралей и /3-листов) и, следовательно, гидрофобных кластеров, которые затем коллапсируют с образованием нежесткого гидрофобного ядра (происходит полная или частичная глобуляризация). Эти два промежуточных состояния являются общими для всех исследованных глобулярных белков. Последующее формирование жесткой третичной структуры может в некоторых белках реализоваться через формирование еще одного промежуточного состояния, которое имеет жестко упакованное гидрофобное ядро при отсутствии жесткой упаковки (фиксации боковых групп) на поверхности;
показано, что скорость цис-транс изомеризации пролиновых остатков может контролировать в достаточно широком временном интервале только последний этап самоорганизации белка приобретение жесткой третичной структуры, в то время как предыдущие этапы самоорганизации не чувствительны к пролиновой
изомеризации.
Выявлен второй внутримолекулярный фактор, замедляющий процесс самоорганизации белков, которым является нестабильность части элементов вторичной структуры в отсутствие специфических (короткодействующих) внутримолекулярных взаимодействий, формирующих жесткую третичную структуру белка.
Установлено, что последовательность основных событий в процессе самоорганизации глобулярных белков не может быть изменена или ускорена молекулярными шаперонами.
Практическая ценность. Установленные закономерности процесса самоорганизации глобулярных белков позволяют вплотную приблизиться к пониманию механизма сворачивания белков, что в свою очередь делает возможным создавать (конструировать) белки с заранее заданными биологическими функциями, более четко представлять процессы, происходящие при созревании белков в клетке, и роль в этих процессах клеточных факторов, т. е. к решению целого ряда биотехнологических и медицинских задач.
Публикации. Основные результаты представленной к защите диссертационной работы опубликованы в 30 печатных работах, включая 17 публикаций в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Апробация. Материалы диссертационной работы докладывались на 1-ом Биофизическом съезде ( Москва, 1982); V-ой Конференции по спектроскопии биополимеров ( Харьков, 1984); VI-ом Симпозиуме по конформационным изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1985) ; Симпозиуме "Физико-химические свойства биополимеров в растворах и клетках" ( Пущина, 1985); V-ой международной конференции молодых ученых по биоорганической химии (Рига, 1938); FEBS congress (Budapest, 1990); международной конференции "Protein biosynthesis" (Путино, 1991) ; VII-ой конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991 ); IV-ой международной конференции "Biophysics and synchrotron radiation" (Tsukuba, Japan,1992); ІХ-ом русско-германском симпозиуме по химии пептидов и белков ( Пущино, 1994 ).
На защиту выносятся:
1). Разработка экспериментального подхода для изучения формирования гидрофобных кластеров и гидрофобного ядра белков в процессе их сворачивания, основанного на использовании
гидрофобного флуоресцирующего зонда.
2). Разработка экспериментальных подходов для изучения глобуляризации белковой цепи в процессе ее сворачивания, основанных на использовании миграции энергии между флуоресцирующими группами, иммобилизации спиновой метки и малоуглового рассеяния рентгеновских лучей.
3). Результаты исследования основных структурных характеристик равновесных и кинетических промежуточных конформационных состояний, накапливающихся на пути сворачивания глобулярных белков.
4). Последовательность основных событий, в,результате которых развернутая белковая цепь приобретает свою жесткую пространственную организацию.
5). Исследование скорости спонтанного сворачивания (самоорганизации) глобулярных белков и лимитирующих ее факторов,
.6). исследование влияния на кинетику спонтанного сворачивания глобулярных белков таких клеточных факторов как молекулярные шапероны.
Данная работа представляет собой первое систематическое исследование процесса самоорганизации глобулярных белков с использованием большого количества адекватных экспериментальных методов и объектов исследования, охватывающих различные структурные классы и источники получения.