Введение к работе
j -аїр.іл і БИБЛИОТЕКА .
Актуальность теми, В настоящее время не подвергается сомнениям значительная роль свободно-радикалышх реакций в метаболических процессах, протекающих в организме как в норме, гак и в патологии. Исключительное место в этих реакциях, в том числе переписного окисления лгашдов (ПОЛ), принадлежит нонам железа. Для протекания процессов ПОЛ огромное значение имеют колігчество ионов железа, а также их степень окислення. Процессы Fe-ітдуцироваиного ПОЛ в сыворотке крови исследованы довольно подробно (например, методом хенилюминесцешціи); в то же время каталитически активного железа в сыворотке обнаружить не удалось [Gutteridge & Hallivell, 1985; Kozlov et aL, 1991]. Этот факт, вообще говоря, ставит под сомнение возможность протекания таких процессов в организме и, соответственно, адекватность выводов об их механизмах Практически единственными источниками ясечеза, откуда последнее может попасть в сыворотку, являются клетки эндотелия, крови и других органов, причем наибольшее колігчество Fe содержится в печени [Gower et aL, 1989). Учитывая это, иояшо предположить, что инициированное ионами железа ПОЛ может протекать на границе ткань-кровь, при выходе Fe из разрушающихся клеток. Однако, протекание таких процессов возможно только в том случае, если каталитически активное железо находится в клетках в форме FeQl), я не менее, чем в ыикромолярных концентрациях.
Что же известно о внутриклеточном пуле каталитически активного железа? Известно, что в клетке существует так называемый транзитный пул железа, который, вероятно, является следствием процесса транспорта железа к местам синтеза железосодержащих белков. Именно составляющее этот пул железо и принимает непосредственное участие в процессах ПОЛ. Несмотря на то, что уже предпринимались попытки изучения железа, составляющего транзитный пул [Ванин, 1967; Тарасова, 1981; Gower et aL, 1989}, эта проблема остается малоизученной. В частности, количественный состав транзитного пула по данным разных авторов колеблется в широком диапазоне, а вопрос о валентности железа, входящего в его состав, вообще не изучался. Вместе с тем,
именно эти два показателя - количество и степень окисления - являются ключевыми дл участия железа в процессах ПОЛ, как, впрочем, и для пошшания внутрихлеточног метаболизма железа.
Если в клетке содержится достаточное количество ионов Fea*, то при разрушении, сопровождающем целый ряд патологических процессов, внутриклеточис железо дожег попасть в кровь и активировать ПОЛ. Но здесь также возникает целы рад невыясненных вопросов, в частности, каков вклад сывороточных белков в общу антиоксидантную активность (АОА) крови, в том числе обусловленную инактивацис ионов железа. Известно, что белкіщерулоплазмин (ЦП) и трансферрин (ТФ) являют* ведущей антиоксидантной системой (АОС) крови; наиболее асе эффективным методе оценки АОА этой системы является метод ЭПР (Козлов с соавт., 1990]. Однако до сих ш отсутствуют достаточно полные сведения о саязи между параметрами сигналов ЭЛ ЦП и ТФ в сыворотке крови, и функциональными свойствами этих белке определяющих их АОА. Наряду с этим, антиокекдантные свойства пршшсьшаї другому белку сыворотки - альбумину [Halliwell, 1988], однако конкретные мехашш его АО/ ве известны.
В литературе отсутствуют какие-либо данные о формировании системы ЦП-ТО! раннем неонатальном периоде и влиянии на этот процесс перинатальной асфикы Кроме того, отсутствуют примеры испельзования измерения активности системы Ц ТФ для конкретных диагностических задач.
Цель и задачи ікследоеания. '{елью настоящей работы явилось выяснение дв вопросов: а) исследование состояния пула свободного эндогенного железа в пече крысы и б) изучение возможности протекания в сыворотке инициирован» эндогенным железом ПОЛ и механизмов его регу лядин сывороточными белками в нот: и патологии. Основными задачами исследования были:
1) Исследовать механизмы протекания реакций двух- и трехвалентного желез хелаторами в модельной системе при различных условиях.
а 2) Разработать способ одновременного определения FettO и FeCffl), яригодл для использования как в модельной системе, так. и в непрозрачных биологичес?
объектах, таких как гомогенаты тканей.
-
Определить количественный к валентный состав "тратнтного"' пула железа в печени крысы.
-
Выяснить возможный механизм Fe-иидуциропаііного ПОЛ в лшшдсодержаїцих компонентах сыворотки крови и роль альбумина в этом процесса
-
Выявить связь между параметрами сигналов ЭПР ЦП и ТФ в сыворотке кроки и их антиоксидантныип свойствами.
-
Исследовать формирование системи ЦП-ТФ в раннем неонатальном периода у здоровых новорожденных и на фоне перинатальной асфиксии.
-
Изучить состояние системы ЦП-ТФ у больных ИБС на фоне гемосорбннн с целью получения диагностически значимого критерия, определяющего необходимость проведения и прогноз эффективности гемосорбционного лечения.
Научмія умизпа. Показано, что при нейтральных рН аскорбиновая кислота (АК) ускоряет окисление FeGl). При этом обнаружено формирование парамагнитных комплексов АК с трехвалентным железой. Доказано отсутствие подобных комплексов in vivo. Показано, что десферал (ДФ) резко ускоряет окисление ионов Fe(ID, причем необходимым участником реакции является кислород. В анаэробных условиях не наблюдалось окисления Fe(II) в присутствии ДФ.
Представлены ' экспериментальные факты, подтверждающие существование свободного железа в ткани печени крысы. Показано, что более 99% всего внутриклеточного свободного железа находится в восстановленном состоянии. Установлено, что в неразрушенной ткани печени крысы количество свободного эндогенного железа составляет 20 нмоль/г ткани.
Показано, что сывороточный альбумин полностью ингибирует Fe-зависимое окисление жирных кислот (ЖК), связанных с гам, и лишь частично ЖК в составе фосфолнпидов липопротеинов, что свидетельствует о его второстепенной роли как антиоксиданта. Било выяснено, что сывороточный альбумин лишь частично инактнвирует ионы железа; его АОА главным образом обусловлена пространеч ленной изоляцией ЖК н ионов железа.
Продемонстрировано наличие высокой корреляции между амплитудой сигнала ЭИР ЦП и егоферроксидазнои активностью в сыворотке крови.
Исследование процесса форилроьшшя системы ЦП-ТФ в раннем неонаталыюм периоде показало, что в первые сутки жизни происходит резкое возрастание отношения ЩІ/ТФ до нормальных значений (соответствующих таковым взрослых доноров) пс сравнении с плодами, у которых индекс ЩІ/ТФ на порядок ниже. Это обусловлеис увеличишем амплитуды сигнала ЭИР ЦП и снижением амплитуды сигнала ЭПР ТФ Последнее связано с виходом железа из состава ТФ на фоне неизменного содержание алопрстеина.
Установлено, что следствием перинатальной асфиксия является угнетешк процесса формирования системы ЦП-ТФ, причем этот эффект выражен тем сильнее чем продолжительнее и тяжелее протекала асфиксия.
Практическое значение работы. Впервые разработан метод одшвременногх определения двух- и трехвалентного железа, пригодный для работы с прозрачными і непрозрачными объектами. Разработан новый метод определения ферроксидазиоі активности ЦП в сыворотке крови, значительно превосходящий по свої» характеристикам известные аналоги.
На основе метода ЭПР разработан критерии необходимости проведеші. гемосорбции: ее рекомендуется проію? .л ь, если исходная величина отношения ЦП/Т< не превышает ОД
Ап-ро<)ация уаботи. Результаты работы были доложены на VII и VD Всесоюзных конференциях "Магнитный резонанас в биологии и медицине" (Звеннгоро, 1989, 1990), IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 1989), V Всемирно конгрессе патофизиологов (Москва, 1091).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 191 стр. їшшинописіюі текста, включает 43 рис и 15 табл. Состоит из введения, обзора литературы (б глаі ьжїодичєской части, экспериментальной части с обсуждением результатов (7 глаі заключения и выводоа Библиографический указатель содержит 201 источник.