Введение к работе
Актуальность проблемы. Для лечения дерматозов (псориаз, витилиго, кожная Т-клеточная лимфома и др.) успешно применяется ПУФА-терапия комбинированное воздействие псораленов и ближнего УФА-излучения (320-400 нм).
Считается, что за терапевтический эффект ПУФА-воздействия отвечает кислороднезависи.мое фотоприсоединение псораленов к ДНК (Musajo L. et а!., 1965). Кислород-зависимым реакциям псораленов всегда отводилась минорная роль в терапии, так как считалось, что они приводят только к побочным, токсическим эффектам (Morison W.L. et al., 1977). Однако, в последнее время возникло предположение, что, как токсические, так и терапевтические ПУФА-эффекты могут реализоваться через стадию образования фотоокисленного псоралена(ФОП)(РоіарепкоА. Ya, 1991).
Предполагают , что в основе механизма ПУФА-терагтии может лежать имиуномодулирующее действие фурокумаринов в комбинации с УФА-излучением на организм. В недавних экспериментах было показано, что ФОП, так же, как и ПУФА-воздействие, модулирует реакцию ГЗТ (Potapenko A. Ya. et al., 1994). Механизм образования ФОП-иммуносупрессоров не изучался. Поэтому изучение механизмов модификации мембран в присутствии ФОП и иммуномодулирующего действия ФОП является актуальной задачей, т.к. полученная информация может служить основой совершенствования ПУФА-терапии.
Фотоокислительные реакции ФК с биомолекулами протекают в растворах с невысокими квантовыми выходами, но в коже роль этих реакций велика, т. к. ФК повышают эритемную чувствительность к УФ-излучению на несколько порядков. Это указывает на то, что должны существовать механизмы химической активации фотоокислительных реакций. Одним из регуляторов внутриклеточных и
внутритканевых процессов может быть Fe(II), так как известно, что ионы железа присутствуют в интактной ткани. Показано (W. Adam et al., 1991), что при УФА-облучении растворов ФК образуются гидроперекиси и диоксетаны, которые, как известно, могут эффективно разрушаться ионами Fe2+. Влияние ионов Fe2+ на ФОП-гемолитики и ФОП-иммуносупрессоры не изучалось.
Целью настоящей работы явилось изучение физических и химических факторов, влияющих на биологические эффекты ФОП:
изучение влияния ионов Fe2+ на мембранотоксические эффекты ФОП-продуктов на эритроциты и перитонеальные макрофаги мышей.
исследование влияния ионов Fe2* на продукты ФОП, отвечающие за иммуносупрессию реакции ГЗТ у мышей.
исследование влияния температуры, интенсивности света и концентрации псоралена при облучении на выход иммунологически активных ФОП-продуктов в водном растворе.
Научная новизна работы. Показано, что двухвалентное железо активирует гемолиз, вызванный продуктами фотоокисления в воде псоралена. Активация связана с тем , что, во-первых, железо(П) вызывает стойкие повреждения в эритроцитах, которые проявляются под действием ФОП; во-вторых, ионы Fe2+ индуцируют образование активных ФОП-гемолизинов, которые нестабильны как сами по себе, так и разрушаются под действием железа(И). Установлено, что ФОП-супрессоры, так же, как и ФОП-гемолизины, разрушаются Fe2+ с образованием лабильных, однако, не менее биологически эффективных продуктов. Выявлено, что зависимость выхода ФОП-гемолизинов в водном растворе от концентрации псоралена при его предоблучении носит экстремальный характер. При низких концентрациях (менее 0,3 мМ) выход гемолизина увеличивался с ростом концентрации псоралена. Однако, при дальнейшем увеличении концентрации выход гемолизина снижался. Предполагается, что снижение выхода обусловлено
4 явлением тушения триплетных состояний псоралена невозбужденными молекулами псоралена. Это указывает на то, что в образовании гемолизина участвуют триплеты псоралена.
Обнаружена невыполнимость закона Бунзена-Роско при образовании ФОП-супрессоров реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Показано, что ФОП-супрессоры образуются более аффективно в разбавленых растворах псоралена и под действием света низкой интенсивности. Предлагается кинетическая схема образования ФОП-супрессоров и ФОП-гемолизинов с учетом экспериментально полученных данных.
Установлено, что гибель макрофагов при совместном воздействии ФОП и железа (II) связана с количеством железоразрушаемого продукта в растворе ФОП. Образование этого продукта зависело от дозы УФА-света и носило экстремальный характер. Токсическое действие на мембраны макрофагов продуктов реакции ФОП с Fe(II) снижалось в присутствии аптиоксиданта ионола, что указывает на участие в этом процессе свободных радикалов.
Показано, что зависимость интенсивности железоиндуцированной хемилюминесценции в водном растворе ФОП от дозы облучения УФА-света носит экстремальный характер. Увеличение интенсивности связывается с накоплением железоразрушаемого продукта во время облучения, снижение - с распадом лабильных продуктов фотоокисления псоралена.
Выявлено, что ФОП-супрессоры при комнатной температуре сохраняют активность в водном растворе в течение как минимум трех суток и быстро распадаются при 58С, что свидетельствует о термолабильности этих фотопродуктов.
Практическая ценность. Результаты проведенных исследований с использованием химических (Fe2+) и физических (интенсивность УФ-излучения, температура) факторов расширяют наши представления об особенностях
5 фотоокислительного механизма повреждения мембран в результате воздействия фотоокисленным псораленом, а также представления об условиях образования продуктов ФОГТ, отвечающих за системные иммунологические эффекты, что важно при разработке новых подходов для совершенствования ГСУФА-терапии. Так как показано, что продукция ФОП-иммуносупрессоров была более эффективной при низкой интенсивности света и низкой концентрации псоралена во время облучения, т.е. при условиях близких к условиям ПУФА-терапии, поэтому предполагается, что при терапевтическом действии, как и в процессе иммуносупрессии, могут быть вовлечены продукты ФОП.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на заседании кафедры медицинской и биологической физики Российского Государственного Медицинского Университета (1995) и заседании отдела биохимии Научно-Исследовательского Института Физико-Химической Медицины (1995), а также на Им Международном Конгрессе по Фотобиологии (1992, Киото, Япония), 5м Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (1993, Марбург, Германия), 10м Ежегодном Совещании Общества Фармакологии Кожи (1993, Гонконг), 22м Ежегодном Совещании Американского Общества Фотобиологов (1994, Скоттсдейл, США), Международной Конференции по Клинической Хемилюминесценции (1994, Берлин), 4м Международном Симпозиуме по ЭПР, Дозиметрии и Применению (1995, Мюнхен/Нюрнберг, Германия), 1м Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (1995, Пущино, Россия), 6м Конгрессе Европейского Общества Фотобиологов (1995, Кембридж, Англия).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа
состоит из трех глав и изложена на 112 страницах, включая 22 рисунка. Список литературы содержит 193 ссылки.