Введение к работе
Актуальность проблемы. Одннн из важнейших направлений современной нейробиологии является изучение молекулярных неханизмов генерации и проведения нервного импульса. В последние годы достигнут значительный прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе ключевых этапов распространения нервного сигнала, и, в частности, процесса секреции нейромедиатора. Полученные в различных лабораториях результаты позволили установить, что в пресинаптической мембране существует высокоорганизованный белковый комплекс, участвующий в процессе экзоцитоза. Однако, несмотря на убедительные доказательства существования такого белкового комплекса, точный механизм его функционирования до конца не известен. В решении этой проблемы целесообразными представляются подходы, связанные с использованием природных нейротокскнов. Среди них особое место занимает а-Латротоксин (а-ЛТ), высокомолекулярный белковый нейротоксин, являющийся главным токсическим компонентом яда паука каракурта Latrodectus mactans tredecimguttatus. Интерес к а-ЛТ обусловлен уникальной совокупностью его свойств: способностью вызывать массированный выброс медиатора из всех известных типов синапсов позвоночных, способностью формировать в ЕЛМ неселективные катионные каналы, наличием в пресинаптической мембране высокоаффинного рецептора. Все эти свойства сделали а-ЛТ ценным инструментом в изучении молекулярного механизма нейросек-реции. Тем не менее, до сих пор оставались нерешенными вопросы, касающиеся молекулярного механизма действия а-ЛТ на пресинапти-ческую мембрану, а именно, последовательность молекулярных событий от связывания рецептора на пресинаптической мембране дп развития эффекта а-ЛТ, заключающегося в стимуляции процесса экзоцитоза. Одним из перспективных подходов к решению этих вопросов, может быть исследование действия а-ЛТ с помощью функциональной экспрессии в модельной системе ооцитов Хвпориз laevis. сочетая в себе современные достижения электрофизиологии, молекулярной биологии и генной инженерии этот метод позволяет исследовать функционально активный экзогенный рецептор или канал, экспрессированный в мембране ооцита, а также осуществить идентификацию структурных генов, кодирующих зкспрессированкые рецепторы или каналы, что в конечном итоге ведет к установлению структурно-функциональных взаимоотношений в белках плазматических мембран.
Цель работы. Цель кЬ' іевований, представленных в данной работе, заключалась в расшифровке молекулярного механизма действия сс-ЛТ. Основные задачи исследования были следующие:
1) Экспрессировать функционально активный рецептор а-ЛТ из
мозга крысы в ооцитах Xenopus laevis я определить фракции нРНК,
кодирующей рецептор а-ЛТ.
2) Определить и проанализировать электрофизиологические
характеристики канала, индуцируемого а-ЛТ в ооцитах Xenopus
laevis, инъецированных мРНК из мозга крысы.
3) Исследовать роль а-ЛТ и рецептора а-ЛТ в формировании
канала, индуцируемого а-ЛТ в мембране ооцитов Xenopus laevis, с
помощью антител к а-ЛТ и к рецептору а-ЛТ.
Научная новизна и практическая ценность работы. В результате исследований была осуществлена экспрессия функционально активного рецептора а-ЛТ из мозга крысы в ооцитах Xenopus laevis и определен молекулярный вес фракций мРНК, кодирующих рецептор а-ЛТ. Впервые зарегистрирован одиночный канал, образуемый а-ЛТ в мембране ооцита и определены некоторые параметры канала, что позволило предложить качественную модель работы канала и сделать заключения, касающиеся молекулярного механизма действия а-ЛТ. Расшифровка молекулярного механизма действия а-ЛТ вносит вклад в фундаментальные представления о молекулярной организации пресинапти-ческой мембраны и принципах действия природных нейротоксинов. Полученные результаты могут найти применение в нейробиологин и медицинской биохимии при изучении молекулярных основ патологических изменений в электровозбудимых тканях.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на двух Гордоновских конференциях: по ионным каналам (NewLondon, США, 1990) и по механизму мембранного транспорта (Plymouth, США, 1991); на Советско-Германском симпозиуме "Рецепторы и ионные каналы" (Москва, 1991); на Международном Биофизическом конрессе (Budapest, Венгрия, 1993); на международном симпозиуме "Ооцкты: инструмент для изучения клеточных и молекулярных процессов" (Arolla, Швеция, 1993); на международном симпозиуме "Динамика и функции биомолекул" (Szeged, Венгрия, 1993).
обьеи и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и содержит 4 таблицы и
23 рисунка. Список литературы содержит 117 наименований. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, и выводов. Обзор литературы состоит из двух глав. Первая глава рассматривает современное представление о механизме действия а-ЛТ. Вторая глава посвящена обсуждению возможностей метода функциональной экспрессии в ооцитах Xenopus laevis.