Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Нековалентные белок-липидньте взаимодействия составляют фундаментальную основу структурной и функциональной организации биологических мембран. К настоящему времени всесторонне исследовано влияние липидов на динамику и функции мембранных белков. Существует обширная информация о модификации лшшдного бислоя мембранными белками в искусственных протеолигшдтых системах [Marsh, 1996; Davis, 1986; McEhlaney, 1986; Wolf, 1994]. Значительно меньше сведений о белок-липидных взаимодействиях в природных мембранах. Основная информация о влиянии белков на лилидную компоненту получена при сравнении состояния липиднои фазы до и после частичного или полного удаления белков [Jost, Griffith, 1980; Davis, 1986; Ikegami, Kinosita. 1986]. С помощью такого подхода в эритроцитарных мембранах выявлено влияние периферических белков на микровязкость, степень упорядоченности и микродомен-ігую организацию липидов [Haest, 1982], тогда как эффекты интегральных белков либо слабы, либо не регистрируются [Van Blitterswijk et al, 1981; Collins, Grogan, 1991; Fiorini et al, 1987]. Другой, более адекватный подход, не связанный с обработкой мембран растворителями или хаотропными агентами, и основанный на избирательной структурной модификации белков, в частности, с помощью протеолиза, использовался на интактных клетках и касался структурной реорганизации мембрані [Mazhul et al, 1982], адгезивных свойств клеток [Konev et al, 1982] и текучести липидов [Devaux, Seigneuret, 1985, Burleson et al, 1978]. Приведенные результаты не позволяют оценить характер белок-липидных взаимодействий в мембранах, а регистрируемые изменения микровязкости мембран - однозначно интерпретировать как реакцию липидов только на расщепление белков, поскольку протеолитическая обработка клеток может запускать сложную цепь биохимических реакций, включая активацию фосфолипаз, различные виды вігутриклеточной сигнализации и др. Задача осложняется тем обстоятельством, что для прнродньгх мембран до сих пор не разработаны четкие критерии, позволяющие надежно интерпретировать данные зондовой флуориметрии как изменения микровязкости липидов, отличая их от артефактов, обусловленных тушением флуоресценции, агрегацией или перераспределением зонда в лигшдшш бислое.
Таким образом, изучение влияния белков на физическое состояние липиднои фазы в природных мембранах является актуальной и недостаточно исследованной проблемой клеточной биофизики, решение которой позволит понять природу белок-липидных взаимодействий и механизм их участия в осуществлении разнообразных мембранных функций.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Диссертационная работа выполнена в рамках плановой темы Института фотобиологии НАН Беларуси по Республиканской комплексной программе фундаментальных исследо-
ваніш (Регуляция 0.3) "Метастабильные напряженные состояния биологических мембран как фактор регуляции функциональной активности клеток".
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было с помощью флуоресцентного зондирования выявить и установить характер влияния ферментативного расщепления белков на физическое состояние липидной фазы в изолированных природных мембранах.
Поставленная цель включала решение следующих, задач:
разработать экспериментальный подход для корректной оценки микровязкости и полярности мембранных лигшдов и измерения тушения флуоресценции пире-на в мембранах не зависящего от микровязкосга;
определить концентрационные и температурные границы применения пирена для оценки микровязкости бислойных и прибелковых липидов, исходя из учета характера его распределения в липидной фазе мембран;
охарактеризовать влияние протеолитической обработки проназой синаптиче-ских и эритроцитарных мембран на микровязкость и полярность липидной фазы;
сопоставить эффекты протсолиза белков в прибелковом и общем липидных пулах.
Научная новизна полученных результатов. Впервые обосновывается и используется регистрация интенсивности флуоресценции в изобестической точке спектра испускания пирена для оценки параметров тушения флуоресценции зонда и определения диапазона концентраций пирена в биологических мембранах, в котором эксимеризация контролируется диффузией и зависит от микровязкости липид-ного окружения. .
Выявлена температурно-индуцированная гетерогенность распределения пирена в липидном бислое мембран.
Показано, что протеолитическое расщепление белков синаптнческлх мембран активирует перекисное окисление лигшдов (ПОЛ), тогда как при том же воздействии в эритроцитарных мембранах продукты ПОЛ не обнаруживаются.
Продемонстрировано, что протеолиз приводит к снижению микровязкости липидной фазы изолированных синаптических мембран, тогда как в эритроцитарных мембранах этот эффект менее выражен и не затрагивает полярную зону липидного бислоя в области глицериновых остатков фосфолштидов.
Установлено, что прибелковый и суммарный липидные пулы сшіалтических мембран различаются по полярности, темлературно-зависимому перераспределению пирена и ответу на протеолиз.
Практическая значимость полученных результатов. Данные по влиянию ферментативного расщепления белков на состояние липидной фазы мембран расширяют и углубляют понимание природы белок-лигшдных взаимодействий и демонстрируют возможность применения протеолгоа как эффективного подхода для изучения структурной организации биологических мембран. Разработанные экспериментальные подходы, позволяющие определять концентрационные и темпера-
турные границы применения эксимернзации пирена для корректной оценки микровязкости лиішдов, а также способ оценки динамического тупіения флуоресценции зонда, могут быть использованы в медико-биологических работах патогенетического и диагностического направления.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
-
Интенсивность флуоресценции пирена в изобестической точке спектра испускания характеризует общий стационарный уровень возбужденных молекул зонда и может использоваться для оценки степени тушения флуоресценции и определения диапазона концентраций пирена в мембранах, в котором эксимеризация контролируется диффузией, а отношение флуоресценции эксимеров и мономеров является мерой микровязкости липидов.
-
При температурах выше 30 С для эритроцитарных и 35 С для синаптиче-ских мембран изменение коэффициента эксимернзации пирена обусловлено увеличением гетерогенности его распределения как в липидном бислое, так и в нрибелко-вой зоне, и не может применяться для определения микровязкости.
-
Протеолитяческое расщепление белков наружной поверхности эритроцитарных мембран вызывает снижение микровязкости в центральной зоне липидного бислоя и существенно не затрагивает область полярных головок липидов. Эффекты протеолиза в липидной фазе выявляются только на мембранах, содержащих большую часть периферических белков, способствующих сохранению интактных белок-липидных взаимодействий.
-
Протеолиз белков синаптических мембран инициирует окислительный процесс в липидах. При ингибировании ПОЛ в липидпой фазе мембран регистрируется снижение упорядоченности и микровязкости липидов как в полярных, так и в гидрофобных зонах липидного бислоя.
Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен при решающем участии автора. Выбор условий эксперимента и анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно.
Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на 1-ом и П-ом Съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 22-23 ноября 1994 г.; Минск, 25-27 июня 1996 г.).
Опублнкованность результатов. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 2 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, включающих: обзор литературы; материалы, объекты и методы исследования; результаты исследования и их обсуждение; выводы. Список цитируемой литературы включает 220 литературных источников. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 28 рисунков.