Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных задач современной энзимологии является установление механизма действия ферментов, выяснение вопроса о том, каким образом химическое строение ферментов обеспечивает их высокую специфическую активность.
Среди большого разнообразия различных ферментов особый интерес представляют ферменты, которые ускоряют химические процессы, протекающие с затратой энергии. К ним относятся различные АТФазы, в частности АТФазы, катализирующие активный транспорт ионов и других веществ против концентрационных градиентов, а также АТФазы, сопрягающие гидролиз АТФ с химическими превращением низкореакционных соединений, таких, например, как молекулярный азот и т.д. Эти ферменты катализируют наиболее важные процессы, происходящие в живой природе.
Нитрогеназа является центральным ферментом биологической фиксации азота и играет ключевую роль в кругообороте азота в природе.
Транспортные АТФазы обеспечивают мышечное сокращение, биоэнергетические процессы, проведение нервного импульса, а также стимулируют процессы биосинтеза.
Пространственная структура этих ферментов мало изучена, так же как и расположение активного центра на глобуле белка и взаимное расположение каталитически активных групп. Из-за методических трудностей получения кристаллов белка метод рентгеноструктурного анализа пока неприменим к большому количеству белков, особенно белков, связанных с биологическими мембранами. В связи с этим в настоящей работе проводилось изучение строения активных центров
нитрогеназы и других ферментов с помощью кинетических и спектральных методов.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование структуры АТФазного центра нитрогеназы и Са-АТФазы, а также нуклеотидсвязывающего центра креатинкиназы с помощью аналогов субстрата методом спектрофлуориметрии.
В задачи исследования входило:
изучить конформацшо є-АТФ в растворе и в АТФ-связывающем центре нитрогеназы, креатинкиназы и Са-АТФазы саркоплазматического ретикулума методами спектрофлуориметрии
выяснить стехиометрию Mo-Fe-белок : Fe-белок в составе азотфиксирующего комплекса
изучить топографию активного центра нитрогеназы различными
спектрофлуориметрическими подходами с использованием є-АТФ
- разработать метод синтеза и изучить спектральные свойства
аналога АТФ, обладающего флуоресцентными и фосфоресцентными свойствами
Научная новизна. Установлено, что є-АТФ с разрывом 2'С-З'С связи рибозного кольца в водном растворе находится в более раскрытой конформации по сравнению с конформацией є-АТФ без разрыва 2'С-З'С связи
спектрофлуориметрическим титрованием Mo-Fe-белка Fe-белком, меченым є-АТФ, показано, что стехиометрия Mo-Fe-белок : Fe-белок в составе азотфиксирующего комплекса равна 1 : 1
е-АТФ взаимодействует с нитрогеназой и Са-АТФазой таким образом, что є-адениновая структура располагается в щели белковой глобулы
є-АТФ в составе азотфиксирующего комплекса находится вблизи Fe-Mo-кофактора
получено новое производное є-АТФ, которое обладает флуоресцентными и фосфоресцентными свойствами
на примере нитрогеназы, Са-АТФазы и креатинкиназы показано, что конформация нуклеотида в активном центре фермента в значительной степени зависит от природы этих ферментов.
Практическая значимость работы. Научные результаты, полученные в настоящей работе, могут быть использованы в лабораториях, занимающихся изучением структуры и механизма действия нитрогеназы, Са-АТФазы и других АТФаз.
Вг-є-АТФ, обладающий флуоресцентными свойствами, может быть рекомендован для исследования топографии АТФ-связывающих центров ряда ферментов различными спектральными методами.
s-АТФ, как было показано нами на примере пестицидов, динуклеотидов и полинуклеотидов /Изв. АН СССР, 1988/, может использоваться в качестве высокочувствительного флуоресцентного зонда для выяснения констант комплексообразования различных ионов металлов с комплексонами высокочувствительными спектрофлуориметрическими методами.
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на IY Всесоюзном биохимическом съезде (Москва, 1979), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на YI Баховском коллоквиуме по биологической фиксации молекулярного азота (Чернигов, 1980), YII Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Тбилиси, 1983), на IY Международном симпозиуме по гомогенному катализу (Ленинград, 1984).
Публикации.По материалам диссертации опубликовано 9 работ.
Структура работы.Диссертация состоит из введения, обзора литературы (I глава), методического раздела (II глава), экспериментальной части (III - Y главы), заключения и выводов.
Материал диссертации изложен на страницах, включает 56 рисунков и 8 таблиц. Список использованной литературы включает наименования.