Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Радиозащита ДНК на первичных, физико-химических стадиях ее лучевого поражения в клетке по свободнорадикальному механизму, как принято считать, связана с реализацией двух процессов: а) конкуренции за радикалы - продукты радиолиза воды между веществом-радиопротектором и биополимером; б) ингибирова-ния свободнорадикальных реакций, по Н.М.Эмануэлю, 1957. Реализация этих процессов при облучении живых организмов вызывает радиозащитный эффект(Эмануэль Н.М.,Бур-лакова Е.Б., Круглякова К.Е., Сапежинский И.И., 1966), а на молекулярном уровне - снижение выхода модификации оснований и различных процессов изменения сахарофосфат-ного остова ДНК.
Анализ данных по радиолизу растворов ДНК в присутствии веществ-радиопротекторов показывает, что восстановление исходной структуры в полимере возможно лишь в том случае, если неспаренный электрон в первичном макрорадикале локализован на 2- дезок-сирибозильном звене. Как известно,при радиолизе углеводов в водных растворах образуются стереоизомеры (эпимеры) исходных соединений: в результате реакций восстановления радикалов сахара, в частности, первичных радикалов дезоксирибозы (Кочетков Н.К., Кудряшов Л.И. и др., 1970-78). Если предположить, что такого типа процесс возможен и при облучении ДНК (образование эпимеров 2-дезоксирибозы), то тезис о восстановлении исходной(первоначальной) структуры 2-дезоксирибозы в реакциях ее радикалов с веществом - ингибитором нуждается в корректировке, а именно: поскольку асимметрическими атомами в 2-дезоксирибозе являются Сі, Сз и Сі, следует ожидать образования продуктов радиолиза - эпимеров именно по этим атомам. Отсюда можно было бы прийти к выводу, что и по реакции ингибитора InH с первичными макрорадикалами С'ь С'з и С'а, имеющими планарные связи С-С и С-0,наряду с восстановлением исходной конфигурации связей - структуры фуранозного цикла(истинного восстановления повреждений ДНК) возможно образование и стереоизомеров(по крайней мере.с 50%-й вероятностью,учитывая возможный подход молекулы InH с двух сторон к "сахарному"радикалу с пленарной конфигурацией химических связей). Поскольку появление таких стереоизомеров должно изменить ориентацию оснований в пространстве, то модифицированные т.о. нуклеотиды (радиация
+ действие InH) могли бы стать в ДНК потенциальными сайтами точечных (транзиций и трансверсий) мутаций.
Отсюда можно сделать вывод, что одна из возможных причин точечных мутаций- пред-мутационные изменения, вызванные образованием эпимеров остатка 2-дезоксирибозы, а другая - согласно общепринятой точке зрения - модификация азотистых оснований. Ряд экспериментальных данных по химической защите генетических систем биообъектов (Моссэ И.Б., 1974,1990; Померанцева М.Д. и др.,1981) косвенно подтверждает вышепри-
веденную точку зрения о "сахарной" природе точечных мутаций.
Представляется, что методом, позволяющим решить эту проблему, является метод компьютерного моделирования (МКМ), которому присущи: а) возможность моделирования пространственных молекулярных структур и их фрагментов, б) возможность оперативных изменений в структурах биомакромолекул под воздействием различных факторов, в) возможность моделирования биохимического процесса по соответствующим элементарным актам. Поэтому МКМ в сочетании с разработанной компьютерной технологией получения количественных параметров взаимодействующих молекулярных структур был избран для решения поставленной задачи. Этот метод позволяет, основываясь на результатах исследований (эксперименты лаборатории физической химии ДНК и других биополимеров ИБХФ РАН и литературные данные) по радиолизу ДНК и соединений, моделирующих ее фрагменты, проанализировать механизмы превращений каждого из 5 типов первичных радикалов 2-дезоксирибозы во всех 4-х дезоксинуклеотидах вплоть до образования конечных молекулярных продуктов деструкции сахарного фрагментам том числе и в присутствии вещества-ингибитора. В отличие от существующих методик моделирования например, рассматривающих взаимодействие поверхностей молекулярных структур по динамическому механизму (Woodcock etal., 1995), используемая оперирует с функциональными группами (активными центрами) реагентов и их промежуточным комплексом (в статическом режиме).
К радиационным процессам модификации ДНК относят образование однонитевых разрывов (ОР), щелочно-лабильных связей (ЩЛС), выделение свободных азотистых оснований (САО), образование 5',8-циклических производных пуринов и т.п. (Амирагова и др., 1964; Рябченко, 1979; Fuciarelli et al., 1985; Swarts, 1995). Все эти повреждения можно связать с превращениями первичных 2-дезоксирибозильных радикалов C'i- С'$- Представлялось интересным определить, с превращениями какого именно радикала связано то или иное повреждение сахарофосфатного остова, количественно оценить вклад каждого из 2-дезоксирибозильных радикалов в эти повреждения ДНК и, наконец.оценить (прогнозировать) максимальный эффект влияния на процессы превращений радикалов в облучаемой клетке вещества-ингибитора (InH) свободнорадикальных реакций (СРР).
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ. Цель данного исследования состояла в том,чтобы,разрабо-тав компьтерную методику моделирования процесса взаимодействия макрорадикалов и молекул веществ-ингибитора СРР, определить стерическую вероятность взаимодействия молекул ингибиторов с макрорадикалами 2-дезоксирибозила по двум альтернативным направлениям: радиозащита (восстановление исходной структуры биополимера) и процесс образования стереоизомеров 2-дезоксирибозы в составе ДНК (потенциальных сайтов точечных мутаций).
1. Предложен метод количественной оценки стерической вероятности взаимодействия любых двух молекул, фрагмента биополимера и молекулы, основанный на компьютерном моделировании(метод окна доступа). Этим методом определена вероятность взаимодействия различных ингибиторов со всеми радикалами сахарного фрагмента ДНК.
-
Этим методом впервые оценена эффективность радиозащиты по повреждениям сахарного фрагмента ДНК и вероятность образования стереоизомеров, исходя из превращений каждого из радикалов 2-дезоксирибозила в присутствии веществ-ингибиторов.
-
Представлена схема образования однонитевых разрывов и выделения свободных оснований, связывающая оба этих процесса с последовательностью превращений одного и того же типа радикалов.
-
Оценена (в первом приближении) принципиальная возможность образования водородных связей между основанием в канонических нуклеотидах и основанием в эпимере-про-
дукте радиационной модификации 2-дезоксирибозы в составе ДНК; оценена вероятность максимального выхода потенциальных точечных мутаций при образовании стереоизомеров 2-дезоксирибозы.
ПРАКТИЧЕСКОЕ И ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ. Разработан метод количественной оценки вероятности взаимодействия любых двух молекул или фрагмента биополимера и молекулы, основанный на стернческом моделировании (метод окна доступа). Для использования метода необходимы сведения о структуре взаимодействующих молекул и хотя бы приблизительное знание механизма взаимодействия. Показана возможность применения метода окна доступа для оценки вероятности взаимодействия всех радикалов 2-дезоксирибозила с различными ингибиторами для определения относительного выхода повреждений ДНК. ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.
1. Метод моделирования реакции замещения R^ + InH, оценка вероятности взаимодействия двух молекул (метод окна доступа).
-
Конструирование 3-мерных моделей исходных нуклеотидов, их радикалов и стереоизомеров 2-дезоксирибозы.
-
Результаты оценки эффективности радиозащиты от повреждений сахарного фрагмента нуклеотида в ДНК, исходя из превращений каждого из радикалов 2-дезоксирибозила при взаимодействии с различными ингибиторами.
-
Оценка выхода потенциальных предмутационных повреждений при образовании эпи-меров 2-дезоксирибозы в реакциях Rck с различными ингибиторами.
-
Сведение материального баланса по промежуточным (радикалы C'„, п=1-5) и основным конечным продуктам радиолиза сахарного фрагмента в В-ДНК.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований доложены на: 3-м Съезде по радиа-диационным исследованиям,14-17 октября 1997, Москва; Международном симпозиуме в рамках международной выставки "Медицина и охрана здоровья. Медтехника и Аптека" (16-19 сентября 1997), Тюмень; Всероссийской конференции с международным участием 16-17 ноября, 1998 г., Москва; V-ой Международной конференции "Биоантиоксидант", 18-20 ноября 1998 г., Москва; И-ом Съезде биофизиков России, 23-27 августа 1999 г., Москва; Ш-й Баховской конференции по радиационной химии, 5-7 июня 2000 г., Москва.
ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.