Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы.
1.1. Электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как фактор, воздействующий на биологические объекты.
1.1.1. Биотропные эффекты ЭМИ СВЧ 11
1.1.2. Иммуномодулирующие эффекты ЭМИ СВЧ 16
1.1.3. ЭМИ и канцерогенез 20
1.2. Фактор некроза опухолей как важнейшее звено при формировании неспецифического иммунного ответа 28
1.2.1. Основные характеристики фактора некроза опухолей. История открытия 28
1.2.2. Роль ФНО в сигнальной трансдукции 33
1.2.3. Роль ФНО при различных патологиях 41
1.2.4. Роль ФНО при канцерогенезе 44
1.3. Онкогенез 53
1.3.1. Микроокружение опухоли. Естественные механизмы противоопухолевой защиты 54
1.3.2. Антиоксиданты как иммуномодуляторы для повышения противораковой 62 резистентности
1.3.3. Биотерапия как новейшее направление в лечении рака. Использование цитокинов в противораковой терапии 67
1.4. Белки теплового шока 74
Глава 2. Материалы и методы.
2.1. Животные и условия облучения 79
2.1.1. Животные 79
2.1.2. Условия иммунизации 79
2.1.3. Трансплантация опухолей 79
2.1.4. Диета с антиоксидантами 80
2.1.4. Условия облучения 80
2.2. Выделение Т-клеток 80
2.3. Выделение перитонеальных макрофагов 81
2.4. Получение поликлональных антител Ig G фракции 82
2.5. Получение конъюгатов типа Ig-пероксидаза 82
2.6. Тест на цитотоксичность 83
2.7. Иммуноферментный анализ 84
2.7.1. Определение титра антител 84
2.7.2 Определение концентрации интерлейкинов 85
2.8. Исследование экспрессии белка теплового шока БТШ 72 86
2.8.1. Приготовление образцов для анализа 86
2.8.2. Электрофорез 86
2.8.3. Перенос белков и иммуноблот 86
2.9. Статистическая обработка полученных данных 87
Глава 3. Результаты исследования и их обсуяадение.
3.1. Исследования in vitro 88
3.1.1. Влияние электромагнитного излучения на продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками 88
3.1.1.1. Влияние ЭМИ на продукцию ФИО 89
3.1.1.2. Влияние ЭМИ на продукцию интерлейкинов 92
3.1.2. Влияние ЭМИ на экспрессию БТШ72 95
3.2 Исследования in vivo 98
3.2.1. Влияние ЭМИ на продукцию цитокинов и экспрессию БТШ72 у здоровых мышей 98
3.2.1.1. Продукция ФИО 10
3.2.1.2. Продукция интерлейкинов 10
3.2.1.3. Экспрессия БТШ 72 10
3.2.2. Исследование влияния ЭМИ на состояние иммунной системы мышей после антигенной стимуляции
3.2.2.1. Количество иммунокомпетентных клеток
3.2.2.2. Антителообразование 109
3.2.2.3. Продукция цитокинов 113
3.2.3. Исследование иммуностимулирующего действия ЭМИ на противоопухолевые ответы. Сравнение эффектов ЭМИ и диеты, содержащей комплекс антиоксидантов 115
3.2.3.1. Количество иммунокомпетентных клеток 117
3.2.3.2. Продукция ФИО 118
3.2.3.3. Продукция интерлейкинов 2 и 3.
3.2.3.4. Сравнение действия ЭМИ и диеты, содержащей антиоксиданты
3.2.3.5. Экспрессия БТШ 72
3.2.3.6. Выживаемость мышей-опухоленосителей 1
Заключение
Выводы
Список литературы
- Основные характеристики фактора некроза опухолей. История открытия
- Микроокружение опухоли. Естественные механизмы противоопухолевой защиты
- Исследование влияния ЭМИ на состояние иммунной системы мышей после антигенной стимуляции
- Сравнение действия ЭМИ и диеты, содержащей антиоксиданты
Введение к работе
В последнее время из-за широкого применения источников электромагнитных излучений (ЭМИ) в среде деятельности человека и необходимости строгой гигиенической регламентации все более актуальной становится проблема воздействия ЭМИ на живой организм. Не вызывает сомнения, что биотропное действие ЭМИ обусловлено частотой излучения и модуляции, уровнем плотности потока мощности, поляризацией электромагнитной волны, геометрией излучения и рядом других параметров. Так, с одной стороны, существуют многочисленные данные о патогенном влиянии низкочастотных магнитных полей и электромагнитных полей промышленной частоты (Григорьев, 2000, Lacy-Hulbert et al, 1998). С другой -обнаружено лечебное действие высокочастотных микроволн, которое применяется в настоящее время в клинике (Бецкий, 2000, Кабисов, 1997). Особенно большое количество работ посвящено выяснению эффектов ЭМИ на канцерогенез (Repacholi et al., 1997, Чехун и соавт., 1999, Bernard et al., 2001). Наименее изученным в этом плане остается действие сверхвысокочастотных (СВЧ) излучений, несмотря на широкое распространение его источников в радиолокации и радионавигации, в спутниковой и радиорелейной связи, в телевидении (Шеин, 2001). Исследование действия ЭМИ на иммунную систему, как основной объект, обеспечивающий защиту организма от внешних условий, является одной из важнейших сторон этой проблемы. Устранение иммунопатологии, сопровождающих протекание многих заболеваний, включая канцерогенез, в настоящее время является одной из важнейших задач, стоящих перед исследователями. Поэтому особую актуальность приобретает поиск новых иммуномодуляторов различной природы. Обнаруженное ранее иммуностимулирующее действие низкоинтенсивного СВЧ-излучения (Vijayalaxmi et al., 1997, Макар, 1998, Novoselova et al., 1999, Fesenko et al, 1999) обеспечивают перспективность исследования корректирующих эффектов ЭМИ СВЧ на иммунную систему животных с иммунопатологиями. Целью настоящей работы было сравнительное исследование как in vivo, так и in vitro иммунотропного действия низкоинтенсивных электромагнитных волн сантиметрового диапазона и зависимости этих эффектов от иммунного статуса экспонированных мышей. Для реализации этой задачи были использованы не только здоровые животные, но и модели иммуноактивированных мышей (антигенная стимуляция) и животных в состоянии иммунодепрессии (канцерогенез). В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
Определение влияния низкоинтенсивного ЭМИ СВЧ на продукцию цитокинов и экспрессию белка теплового шока 72 (БТШ 72) иммунокомпетентными клетками при исследовании in vitro.
Изучение действия ЭМИ на цитокиновый профиль и уровень синтеза БТШ у здоровых мышей при облучении in vivo.
Выяснение влияния ЭМИ на состояние иммунной системы мышей после антигенной стимуляции.
Исследование иммуномодулирующего действия ЭМИ на противоопухолевые ответы мышей на разных стадиях канцерогенеза и сравнение этих эффектов с действием диеты, содержащей комплекс антиоксидантов.
В ходе проведенной работы показано, что электромагнитное излучение сантиметрового диапазона не вызывает изменения количества иммунокомпетентных клеток у здоровых мышей, но влияет как in vitro, так и in vivo на цитокин- секреторные функции этих клеток. Впервые продемонстрировано, что низкоинтенсивное излучение разнонаправлено влияет на концентрацию провоспалительных цитокинов, стимулируя продукцию фактора некроза опухоли, снижая уровень интерлейкина 2 и не измененяя концентрацию интерлейкина 3. Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что слабое электромагнитное излучение стимулирует иммунный ответ как у здоровых мышей, так и у животных, находящихся в состоянии иммунопатологии. При этом уровень этой стимуляции не превышает величин, обусловленных физиологическим потенциалом клеток. Показано также, что ЭМИ стимулирует процессы антителообразования у мышей, проявляя аддитивность с адъювантом. Кроме того, в отличие от действия диеты с антиоксидантами, слабое сантиметровое излучение стимулирует противоопухолевую резистентность организма мышей при иммуносупрессии, вызванной канцерогенезом; при этом действие ЭМИ гораздо эффективнее при коррекции сравнительно более тяжелой формы иммунодепрессии.
Обнаружено, что низкоинтенсивное электромагнитное излучение сантиметрового диапазона как in vitro, так и in vivo вызывает значительное повышение уровня экспрессии белка теплового шока 72 у здоровых мышей и опухоленосителей. Исследования носят также и практический характер. Так, с одной стороны, результаты работы вносят существенный вклад в понимание механизмов биологических, в частности, иммунотропных эффектов слабых электромагнитных излучений. С другой стороны, обнаруженные стойкие иммуномодулирующие эффекты ЭМИ позволяют утверждать о перспективности использования фракционированного низкоинтенсивного электромагнитного излучения сантиметрового диапазона при лечении злокачественных опухолей, иммунореабилитации и адъювантной терапии.
Основные характеристики фактора некроза опухолей. История открытия
История открытия ФНО начинается в 1891 году, когда W.Coley (Coley, 1891) впервые предпринял попытки лечения больных раком вытяжками из культур стрептококка. В результате у некоторых больных рост опухолей подавлялся, другие же погибали от кахексии, не связанной с онкологическим заболеванием. Именно тогда и возникло предположение о губительном воздействии на опухоль каких-то факторов, появляющихся в ответ на введение бактериальных вытяжек. Затем в 1931 году было продемонстрировано возникновение геморрагических некрозов опухолей в эксперименте на животных после инъекций бактериальных фильтратов (Gratia & Linz, 1931). Позже, в 1943 году удалось выделить и очистить бактериальный продукт, инъекции которого приводили к геморрагическим некрозам трансплантируемых опухолей у мышей, этот продукт был назван "бактериальным полисахаридом" (Shear et al, 1943). Затем гистологическими исследованиями была обоснована ишемическая природа геморрагических некрозов опухолей и высказано предположение, что именно введение бактериального эндотоксина вызывает геморрагический некроз (Algire et al, 1952). В 1962 году в опытах на мышах было доказано, что геморрагические некрозы в опухолях после введения бактериального липополисахарида (ЛПС) обусловлены действием не самого ЛПС, а какого-то промежуточного фактора, который появляется в сыворотке крови в ответ на инъекцию. Эта сыворотка обладала способностью убивать опухолевые клетки при введении другим мышам, которые не получали инъекций ЛПС ((Г Malley et al, 1962).
В 1975 году в группе Лойда Олда (Old, 1985; Carswell et al., 1975) было обнаружено, что после инъекции липополисахарида в крови мышей, сенсибилизированных М. bovis, появляется фактор белковой природы, который вызывает некроз опухолевых клеток и при этом не затрагивает здоровые клетки и ткани. Такие селективные киллерные свойства были затем подтверждены при использовании всех известных линий трансформированных клеток (Matthews, Watkins, 1978; Matthews, 1978), что вызывало большие надежды у исследователей канцерогенеза и клиницистов. Белок получил название "tumor necrosis factor" или «фактор некроза опухолей». Как выяснилось позднее, название отражает лишь одну из функций этого соединения, уникального по многообразию участия в регуляции метаболических процессов во всех структурах.
В настоящее время уже точно идентифицирована структура ФНО, условия его синтеза (Beutler В., Cerami А., 1988, Chcialowski et al., 1997). Установлено, что ФНО представлен двумя клеточными медиаторами: кахектином (ФНОа) (Yamazaki 1994, Maranda & Robak 1997) и лимфотоксином (ФНО0). Еще в 1980-1983 годах разными авторами независимо друг от друга было установлено, что ФНО а (кахектин) - продукт активированных макрофагов (Mannel et al., 1980; Williamson et al., 1983). Лимфотоксин по своей структуре и по происхождению имеет близкое сходство с кахектином. Он вырабатывается Т-лимфоцитами и В-лимфобластами в ответ на специфическую антигенную или неспецифическую митогенную стимуляцию. Этот медиатор, в отличие от кахектина, не вырабатывается макрофагами и не вырабатывается в ответ на появление бактериальных ЛПС. При синтезе лимфотоксин продуцируется в меньших по сравнению с кахектином количествах, скорость его накопления ниже, чем скорость образования кахектина (Li et al, 1987, Porter, 1990).
Лимфотоксин был впервые описан как цитотоксический белок, играющий важную роль в двух типах реакций гиперчувствительности (Ruddle & Waksman, 1968). Ранние публикации подтвердили цитотоксические эффекты лимфотоксина в отношении различных видов опухолей, показали его иммунорегулирующую функцию при аутоиммунных процессах и иммунодефицитных состояниях (в т.ч. при СПИДе) (Old, 1985; Ruddle, 1986, 1987). Сравнительная оценка структуры кахектина и лимфотоксина приведена в таблице 1. При этом гены ФНОа и ФНОр независимо регулируются различными цитокинами. Различия биологических активностей могут быть связаны различиями в характере их взаимодействия с общими рецепторами (Porter, 1990). Функции, выполняемые в здоровом организме кахектином и лимфотоксином, очень разнообразны. Во-первых, ФНО действует непосредственно на разные типы клеток. Так, в сравнительно низких концентрациях (10"9 М) ФНОа усиливает адгезивные свойства нейтрофилов и эндотелиальных клеток сосудов, вызывая экспрессию новых адгезивных молекул на их поверхности и разрыхляя межклеточный матрикс. Кроме того, фактор некроза опухоли способствует активации нейтрофилов, усиливая фагоцитоз и продукцию супероксидных радикалов, а также экспрессию рецепторов комплимента на нейтрофилах (Beutler & Cerami, 1989, Brown, 1991). ФНОа является аутокринным и паракринным активатором макрофагов, служит хемоаттрактантом для макрофагов и клеток Лангерганса в коже (Зубова & Окулов, 2001).
Этот цитокин регулирует многие процессы кроветворения. Известно, что ФНО -а, ФНО-Р и ИЛ-6 способны вызвать ингибирование всех типов колоний ранних костномозговых предшественников, возможно, это действие опосредуется через ПГЕг, синтез которого увеличивается под воздействием ФНО. В литературе имеются противоречивые сведения в отношении антипролиферативного эффекта ФНО на нормальные клетки. Известно, что ФНО ингибирует все типы колониеобразующих единиц в нормальном костном мозге (Akashi К. et al., 1992). Кроме того, этот цитокин способен стимулировать рост клеток за счет активации ростовых факторов, инициировать секрецию некоторых других цитокинов, например, ИЛ-1, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерферона g (Kimber & Cumberbatch, 1992). Результаты экспериментальных и клинических исследований приводят к выводу, что ФНО наряду с некоторыми другими цитокинами (ИЛ-1, ИЛ-2) активно участвует в регуляции болевой чувствительности и патогенезе болевых синдромов (Василенко, 2000).
При исследовании кожной чувствительности у мышей обнаружили, что экспрессия ФНОа контролируется в пространстве и времени. В этой работе показано, что усиление экспрессии мРНК наблюдается уже через 10 мин после обработки кожи мышей оксазолоном, но эта стимуляция длится не дольше 20 минут (Flint et al, 1998).
Известно, что внутриклеточный синтез фактора некроза опухолей контролируется глюкокортикоидными гормонами на транскрипционном и посттранскрипционном уровне (Beutler, 1990). Из эндогенных медиаторов стимулируют продукцию ФНО ИФНу (van Valen et al, 1997, Ueda & Yamazaki, 2001), макрофагальный колониестимулирующий фактор, (Beutler В. et al., 1986, 1988), интерлейкины ИЛ 2 (Reddy et al, 2001), ИЛ 4, ИЛ 6, ИЛ 10, ИЛ 13 (Singh et al, 2000), ИЛ 11 (Redlich et al, 1996), ИЛ 17 (Jovanovic et al, 1998). Некоторые виды вирусов, продукты жизнедеятельности бактерий, трипаносом, плазмодия индуцируют выработку кахектина (Beutler & Cerami, 1988). Как важнейшие стимуляторы эндогенного синтеза ФНО исследованы также некоторые полипептиды (Ueda & Yamazaki, 2001), липополисахариды (Lee & Sullivan, 2001, Pfister et al, 1992), инсулин (Iida et al, 2001), 2,3,7,8-тетрахлородибензо-р-диоксин (Rier et al, 2001). Величина уровня синтеза ФНО под действием стимулирующих факторов изменяется по-разному. При использовании, например, липополисахаридов продукция ФНО возрастает в 10-100 раз (Vassali, 1991), активация экспрессии гена, регулирующего синтез ФНО, возрастает в 30 раз при гипертермии (Katschinski et al., 1999), острое летальное у-излучение также резко увеличивает продукцию ФНО (Sherman et al., 1991). Большая по величине активация синтеза ФНО при повреждающих факторах объясняется редкой для клеток млекопитающих системой регуляции этого цитокина по принципу отрицательной обратной связи. При высокой концентрации ФНО в организме возникают токсические эффекты, такие как интенсификация боли, снижение массы тела, метаболический ацидоз, повреждение структуры внутренних органов, кахексия и даже геморрагический некроз органов. В этих случаях для блокировки внутриклеточного синтеза ФНО используют актиномицин D, циклогексимид, простагландин Е2, NO (Eigler et al, 1995), рибозим (Kisich et al, 1999), некоторые антиоксиданти (van Valen et al, 1997), геранин, сорилагин (Okabe et al, 1999, 2001), талидомин, другие природные ингибиторы (Habtemariam, 2000).
Микроокружение опухоли. Естественные механизмы противоопухолевой защиты
Угроза перерождения нормальной клетки в опухолевую и дальнейшее противостояние организма-хозяина агрессии со стороны злокачественного новообразования зависят от нормального согласованного функционирования всех гуморальных и клеточных систем организма и сохранения целостности его внутренней среды (Shacter & Weitzman, 2002).
При развитии злокачественных заболеваний организм претерпевает ряд изменений как на уровне генома, так и на уровнях клетки, ткани и органа. В результате воздействия физических факторов, химических агентов, эмоционального стресса, гормональной, а также вирусной инфекции в клетке происходят изменения уровня перекисного окисления липидов и поверхностной структуры клетки (рис 1.). За этим следует нарушение в функционировании различных сигнальных систем. Возникшие биохимические и структурные нарушения запускают либо адаптивные механизмы клетки, приводящие к нормализации ее жизнедеятельности, либо программу гибели по апоптическому пути. Однако при избыточном действии одного или нескольких мутагенов в результате срыва адаптивных механизмов в клетке могут происходить нарушения нормальных процессов, протекающих в ее генетическом аппарате. Опухолевую клетку характеризует комплекс нарушений на генном, хромосомном и геномном уровнях, которые выражаются в разнообразных типах точечных мутаций, хромосомных аберраций и изменении числа хромосом. Эти нарушения инициируют искажение сигнального и генетического аппарата клетки. (Якубовская, 2000, Турусов, 1993). В настоящее время обнаружено более 100 транслокаций, типичных для клеток, лейкозов и лимфом, а также десятки транслокаций и делеций для клеток солидных опухолей человека (Berger, 1999, Bishop, 1991).
Известно, что в процесс малигнации вовлечены 3 основных класса генов. Это онкогены, антионкогены и гены, экспрессирующие мишени для онкобелков и антионкобелков (гены трансформации). Инактивации или супрессии нормальных генов и антионкогенов и активации протоонкогенов и онкогенов является следствием перепрограммирования генома. В качестве онкогенов при развитии злокачественных новообразований выступают гены факторов роста, контролирующие процессы роста и деления клетки (например, ТФР-а), рецепторы этих факторов, гены, кодирующие синтез участников сигнальных путей (N-ras), факторов активации, транскрипции (с-myc, N-myc), гены, контролирующие рост и размножение клеток и клеточного цикла (р53, р16 и др.). (Георгиев, 1999). В патологических случаях процесс реанжировки приводит к ошибочному связыванию сегментов иммуноглобулиновых генов с клеточными онкогенами (c-myc, Bcl-1, Bcl-2, Bcl-66 HER-2), обеспечивающими раковой клетке преимущественные условия для выживания (Серебряная и соавт., 2001, Юдина и соавт., 2001, Rogers et al., 2002). Так, например, при лимфоме Беркитта ген c-myc перестраивается в область одного из локусов генов иммуноглобулинов и экспрессируется в большом количестве, обеспечивая клетке длительный пролиферативный стимул, приводящий к агрессивному заболеванию (Серебряная и соавт., 2001). В развитии опухолевой прогрессии при В-клеточных лимфомах критическая роль принадлежит, по-видимому, гену р53, относящемуся к группе генов, супрессирующих опухоль (Лукьянова, 2000, Holden & Mooney, 1999). Перепрограммирование генома сопровождается искажением сигнального, рецепторного, биохимического аппарата клетки и приводит к созданию условий для неконтролируемого роста, нарушения в программах клеточной дифференцировки и гибели клетки, а также способности к метастазированию и к условиям механизмов устойчивости клеток к различным воздействиям (рис. 1.4.). Такая клетка дает потомство, которое способно расселяться за пределами базальных мембран.
Рост и развитие опухоли связанное с этим массированное появление онкогенов вызывает комплекс биологических реакций, в котором можно выделить три основных компонента: активацию противоопухолевой защиты хозяина, подавление защитных механизмов и (или) их переориентация на содействие развитию опухоли (Балдуева, 2001; Bani et al., 1995). Остановимся подробно на каждом из них.
Известно, что в процессе эволюции организм выработал некоторые защитные механизмы против развития новообразований. Достаточно будет сказать, что не каждая мутация приводит к малигнации, большинство из трансформированных клеток распознаются как чужеродные и уничтожаются с участием главного комплекса гистосовместимости в процессе нормального функционирования организма. В активации противоопухолевой защиты, например, при остром лейкозе, играет немаловажную роль увеличение количества иммуноглобулинов IgM, IgG, IgA (Белевцев, 2001). Однако низкодифференцированные трансформированные клетки обычно не несут на себе чужеродных рецепторов, поэтому для борьбы с ними в организме имеются другие механизмы (рис. 1.5.).
Исследование влияния ЭМИ на состояние иммунной системы мышей после антигенной стимуляции
Еще одним эндогенным ростовым фактором, стимулирующим прогрессию опухоли, является фактор роста фибробластов (ФРФ). Экспрессия ФРФ обеспечивает большую автономию опухолевых клеток, усиливает их пролиферативную активность и приживляемость, отчасти за счет экспрессии фермента циклооксигеназы 2 (СОХ-2) (Kage et al, 1999). Увеличение экспрессии СОХ-2 делает клетку более устойчивой к сигналам апоптоза, в том числе путем задержки в фазе G1 клеточного цикла (DuBois, 1996).
Уровень синтеза ФНО на начальных стадиях злокачественного роста значительно повышается, что свидетельствует о противоопухолевой резистентности организма в ответ на развитие рака (Kurachi et al, 2001; Trejo et al, 2001; Володько и соавт., 1994). Устойчивое увеличение уровня синтеза этого цитокина можно считать маркером злокачественных новообразований (Kurachi et al, 2001). Однако известно, что ФНО-а продуцируются не только иммунокомпетентными клетками организма опухоленосителя, но и опухолевыми клетками некоторых карцином. В этом случае ФНО-а, вырабатываемый клетками опухоли, может способствовать развитию опухоли, во всяком случае, стимулируя рост и развитие раковых клеток, нечувствительных к действию этого цитокина (Окулов и Зубова, 2000). Поэтому повышенный уровень экспрессии ФНО клетками опухоли ассоциируется с худшим прогнозом (De Vita et al, 1998).
Другим механизмом толерантности опухоли к воздействию иммунной системы может являться экспрессия гена MDR, который кодирует Р-гликопротеин. В норме Р-гликопротеин связан с процессами детоксикации и обеспечивает «пассивную» защиту клетки и ее адаптивный ответ на токсические внешние воздействия. Однако недавно было показано, что Р-гликопротеин-синтезирующие клетки устойчивы к действию ФНО (Smyth et al, 1998). То есть, клетки, контроль над пролиферацией которых со стороны организма ослаблен, приобретают преимущества к выживанию за счет экспрессии гена MDR (Holden & Mooncy, 1999). Кроме того, устойчивость опухолевых клеток может быть связана с изменениями в метаболизме церамидов (Luccietal, 1999).
Рассмотренные здесь механизмы все же не исчерпывают многообразия того сложного процесса, который определяется понятием «прогрессия опухоли». Каждый вид опухоли характеризуется своим собственным набором защитных механизмов, запуск которых определяется степенью малигнации.
Известно, что нарушения в антиоксидантных механизмах коррелируют с проявлением малигнантного фенотипа. При прогрессии злокачественного роста обычно наблюдается повышенная активность супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы и снижение активности каталазы и экспрессии мРНК каталазы в опухоли, уровня глутатиона, витаминов С и Е. Такие изменения характерны для прогрессирующих новообразований у мышей (Gupta et al, 2001), в тканях больных раком кишечника (Skrzydlewska et al, 2001), при раке легкого у людей и в линии клеток карциномы легкого А549 (Chung-man Но et al, 2001). Подобные перестройки антиоксидантной системы могут привести к повышению уровня Н202 и, следовательно, к возможному возникновению повреждений ДНК, способствующих дальнейшему развитию злокачественного роста.
Множество проведенных исследований показали, что злокачественные заболевания сопровождаются также выраженными комплексными заболеваниями со стороны иммунной системы. На фоне опухолевого процесса формируется цитокиновая дисрегуляция в виде изменения синтеза и секреции цитокинов иммунокомпетентными клетками. Например, при злокачественных новообразованиях значительно уменьшается продукция ИФН, ИЛ-2, ИЛ-12 лимфоцитами периферической крови, что нередко коррелирует со снижением продукции киллерных клеток. Это происходит на поздних стадиях опухолевого процесса. Снижение продукции ИЛ-2 может быть связано с иммуносупрессивным эффектом простагландинов, иммунных комплексов, продуктов метаболизма опухолевых клеток (Shibata et al., 2002). При онкологических заболеваниях рост опухолей сопровождается повышением уровней ИЛ-ір, что нередко сочетается с неблагоприятным прогнозом течения заболевания (Kisseleva et al., 2001). Уровни синтеза ИЛ-6, ИЛ-10 и ИЛ-12 зависят от вида, стадии и локализации злокачественного новообразования. Например, при ларингальной карциноме концентрации этих цитокинов обычно снижены (Pignataro et al., 2001), а при раке прямой кишки уровни экспрессии этих белков иммунокомпетентными клетками пациентов повышены по сравнению с нормой (Galizia et al, 2002). В то же время отмечается изменение соотношения CD4/CD8 лимфоцитов и активизация процессов фагоцитоза, свидетельствующие об усилении механизмов противоопухолевого иммунитета (Новик и соавт., 2001).
Если у первичных больных выявленные изменения свидетельствуют о некоторой активации гуморального и фагоцитарного звеньев иммунитета, а также механизмов естественной цитотоксичности, то в дальнейшем в ходе лечения у них развивается выраженный вторичный иммунодефицит. Дальнейшее действие злокачественного новообразования на организм приводит к развитию опухолезависимой иммуносупрессии, которая может быть опосредована как сывороточными, так и клеточными факторами. К сывороточным относят экспрессию острофазных белков, простогландинов, повышенный уровень ИЛ-10, ТРФ(3, фактора роста эндотелия, протеиназ, коллагеназы. К клеточным - инфильтрация опухоли предшественниками гранулоцитов, снижение продукции ИФН и ИЛ-2, низкая экспрессия адгезивных молекул и Т-активирующих факторов, повышенный синтез молекул, ингибирующих распознавание антигенов и мутации р53, гиперэкспрессия HEP-2/neu (Мкртчан и соавт., 1986; Hadden J.W., 1999). На следующих стадиях опухолезависимая иммунодепрессия проявляется в анергии иммунной системы, депрессии кроветворения и снижении активности макрофагов (Останин и соавт., 1996).
Таким образом, на фоне онкологического процесса формируются выраженные иммунные нарушения, снижающие активность естественных противоопухолевых механизмов. Исследования в области фундаментальной иммунологии и иммунологии опухолей должны стать основой для более глубокого изучения взаимоотношений «опухоль»-«иммунитет» и возможностей интенсификации как процессов воздействия на опухоль, так и процессов активизации компонентов, обеспечивающих естественный противоопухолевый защитный механизм.
Сравнение действия ЭМИ и диеты, содержащей антиоксиданты
Важнейшим направлением биотерапии может стать применение природных биологически активных агентов, играющих важную роль в канцерогенезе, например, фактора некроза опухолей.
Фактор некроза опухолей - это важнейший цитокин, который продуцируете иммунокомпетентными клетками в ответ на инфекцию или повреждения. ФНО одной стороны играет важную роль в регуляции нормальной дифференцировки, рост и метаболизма различных клеток, а с другой выступает в роли медиатор патологических иммуновоспалительных процессов при различных заболевания человека (Cross et al, 1995, Wallach et al, 1997). ФНО проявляет многочисленны иммуномодулирущие и противовоспалительные эффекты, подавляющее болыпинств из которых могут иметь фундаментальное значение в иммунопатологии различных заболеваний. Однако введение рекомбинантного ФНО in vivo ограничивается весьма высокой токсичностью этого цитокина и образованием тромбозов. Поэтому так важно исследовать возможности управления эндогенным синтезом фактора некроза опухолей при канцерогенезе.
На данном этапе нашей работы мы исследовали влияние фракционированного ЭМИ СВЧ (8,15-18 ГГц, 1 мкВт/см2) на продукцию ФНО ИКК мышей-опухоленосителей с разной скоростью развития новообразований. В качестве иммунодепрессивной модели использовали мышей-опухоленосителей с различной скоростью роста новообразований. 2 модели солидных опухолей формировали трансплантацией клеток асцитной карциномы Эрлиха в концентрации 2x105 и 2x106 клеток/мышь. В первом случае наблюдали более медленный рост опухолей, во втором — быстрый процесс развития новообразования.
Данные о продукции ФНО в макрофагах мышей через 7 дней после трансплантации раковых клеток и начала воздействия электромагнитным излучением представлены на рис. 3.13. Показано, что опухолевый рост вызывает заметное повышение продукции ФНО на начальной стадии канцерогенеза при медленном развитии опухоли; это можно расценивать как адаптивный ответ организма, направленный на разрушение раковых клеток. Однако для опухоленосителей с быстрым ростом новообразований не наблюдали достоверного повышения концентрации ФНО по сравнению с контрольными мышами.
При фракционированном облучении здоровых мышей продукция ФНО в макрофагах облученных животных возрастала примерно в 2,5 раза. При этом ЭМИ вызывало повышение уровня ФНО в макрофагах опухоленосителей как с «быстрой», так и с «медленной» скоростью опухолевого роста.
Похожая тенденция была выявлена и для Т-лимфоцитов мышей (рис. 3.14). Трансплантация мышам клеток асцитной карциномы Эрлиха в концентрации 2x105 клеток на мышь вызывала на 7 день достоверное увеличение концентрации ФНО в Т-лимфоцитах опухоленосителей по сравнению с контрольными животными.
Сантиметровые электромагнитные волны стимулировали продукцию ФНО в Т лимфоцитах как здоровых мышей, так и опухоленосителей обеих использованных моделей канцерогенеза. Фракционированное облучение животных с быстрым ростом новообразований вызывало значительное повышение концентрации ФНО; при этом сам опухолевый рост не вызывал достоверного увеличения уровня продукции этого цитокина в Т лимфоцитах, как это было показано для макрофагов. Интересно, что активирующее действие слабых электромагнитных волн в отношении опухоленосителей с более быстрым ростом новообразований было значительно эффективнее. Так, применение ЭМИ повышало уровень продукции ФНО до 420 и 320 % от контроля соответственно для быстрой и медленной модели канцерогенеза.
Далее мы исследовали эффективность действия ЭМИ на уровень синтеза ФНО на более поздней стадии развития опухоли (рис.3.15). Через 14 дней после трансплантации опухоли концентрация этого цитокина в макрофагах мышей при медленном развитии злокачественной опухоли была гораздо выше, чем у животных с более быстрым ростом новообразований, но ниже уровня макрофагального ФНО, измеренного на 7 день после трансплантации (сравнить рис.3.13. и 3.15). Такие результаты свидетельствуют о снижении адаптивного противоопухолевого ответа на более поздней стадии канцерогенеза. Как видно из рисунка 3.15., быстрый рост экспериментальных опухолей настолько угнетает иммунную систему животных, что на 14 день этого процесса уровень продукции ФНО снижается в 5 раз по сравнению со здоровыми животными. При исследовании возможности модуляции уровня продукции фактора некроза опухолей в клетках опухоленосителей с помощью ЭМИ обнаружили, что при медленной скорости роста опухоли фракционированное облучение вызывает стимуляцию продукции ФНО до величин, превышающих степень активации синтеза этого цитокина как при облучении здоровых мышей, так и при опухолевом росте необлученных животных. Это свидетельствует о способности электромагнитных волн крайне низкой интенсивности увеличивать период, в течение которого организм опухоленосителей еще может формировать адаптивный ответ на злокачественный рост. Особенно важно, что на фоне угнетения продукции ФНО у животных с быстрорастущими опухолями применение ЭМИ приводит к значительной стимуляции продукции цитокина в клетках опухоленосителей этой группы.
