Идентификация молекулярных структур рецепторов Са2+-антагонистов и кинетики Са2+ каналов Бирюков, Станислав Анатольевич

Введение к работе

Актуальность исследования.

В 60х годах Fleckenstein обнаружил, что различные вещества способны избирательно блокировать входящие Са²* токи, вызванные деполяризацией клеточной мембраны. Исследования, выполненные на клетках сердечных и гладких мышц, показали, что это ведет к уменьшению сократительной силы и делает невозможным проведение потенциала действия (Fleckenstein et al., 1983). Увеличение концентрации Са²* вновь увеличивало силу мышечных сокращений и восстанавливало проводимость Са²* потенциала действия. Это дало повод ввести термин Са²* антагонисты.

Особый интерес представляет взаимодействие потенциалоуправляемых Са²* каналов с широко используемыми в клинической практике 1.4-дигидропиридинами (ДГП, например нифедипин и нитрендипин), фенилалкиламинами (ФАА, галлопамил и верапамил) и бензотиаэепинами (БТЗ, д-цис дилтиазем).

Фармакологическая активность Са²* антагонистов, например их антиаритмическое и ваэодилятаторное действие, объясняется потенциало- и частотозависимым (для ФАА и БТЗ) блокированием проникновения ионов Са²* через каналы L-типа в гладких и сердечных мышцах.

Блокирование потока двухвалентных ионов через Са²* каналы определяется высокоспецифичным взаимодействием Са²* антагонистов с соответствующими рецепторами (Caterall et al., 1992, Striessnig et al., 1993).

Исследования подавления Са²* токов постоянно заряженными лигандами, такими как четвертичные производные ФАА галлопамила и БТЗ SQ 32,428, ДГП амлодипин (Hescheler et al., 1982, Kass et al., 1991, Hering et al., 1993), методом локальной фиксации потенциала ("Patch Clamp" ) на изолированных клетках позволили сделать вывод о том, с какой стороны мембраны расположен

соответствующий рецептор (предполагается, что из-за своего постоянного заряда подобные лиганды не могут проникать через клеточную мембрану).

Са²* каналы состоят из нескольких субъединиц. Каждая субъединица кодируется определенным геном. Ионопроводящая структура (пора) канала формируется ой субъединицей (молекулярный вес 195 кД, рис. 1), на которой расположены рецепторы Са²* антагонистов и токсинов. 2-5- (180 кД) и у- (33 кД) субъединицами. Принято считать, что "минимальная функционирующая" структура Са^г* канала состоит из си, Р и ОС2-5 субъединиц (Mikami et al„ 1989, Perez-Reyes et al„ 1989, Lacerda et al, 1991, Hullin et al., 1992, Jay et al., 1992, Birnbaumer et al., 1994).

|| ЦІ IV Связывание

_{о, АллА Мл}

cCa^J*

Активация Место связывания Инактивационная coo

с р субъединицей кинетика

Инактивационная

кинетика _ _

Рис. 1. Олигомерная структура сц-субъединицы Са²* канала.

Показана локализация структурных элементов, определяющих

воспроизведение некоторых важных функций.

Исследования с использованием антител и фотоактивных меток показали, что рецепторы Са²* антагонистов расположены рядом или в самом устье поры а.\ субъединицы (Caterall et al., 1992, Miller et al., 1992, Striessnig et al., 1993).

Анализ первичной структуры показал, что а₍ субъединица состоит из четырех гидрофобных доменов (I-IV). Каждый домен состоит из шести трансмембранных спиралей - сегментов (S1-S6).

Используя методы молекулярной биологии Hockerman et al., 1995, и Doering et al., 1996, определили, что молекулярные структуры высоко аффинных рецепторов ФАА локализованы в сегменте IVS6 си субъединицы L-типа.

На момент начала работы оставались неизвестными молекулярные структуры БТЗ и ФАА рецепторов.

Цель исследования.

Целью представленного исследования было: изучить молекулярные структуры рецепторов Са²* антагонистов классов БТЗ и ФАА в потенциалоуправляемых Са²* каналах L-типа.

Для этого было необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать особенности взаимодействия постоянно заряженного ФАА девапамила с Са²* каналами L-типа.

2. Исследовать взаимосвязь между первичной структурой Са²* канала и его свойствами.

3. Выбрать оптимальную для решения данной задачи систему для экспрессии экзогенных Са²* каналов.

4. Охарактеризовать клеточную линию НЕК 293 как систему для экспрессии и исследования экзогенных Са²* каналов.

5. Исследовать структуру БТЗ и ФАА рецепторов Са²* каналов.

6. Исследовать взаимосвязь инактивации и блокирования канала БТЗ и ФАА.

Научная новизна.

Впервые исследован постоянно заряженный ФАА (четвертичный девапамил), который активен как с внешней, так и с внутренней стороны клеточной мембраны.

4 Таким образом, впервые показано, что ФАА рецептор доступен для связывания с обеих сторон клеточной мембраны.

Впервые показано принципиальное отличие основных характеристик блокирования канала постоянно заряженными ФАА с внешней и внутренней сторон клеточной мембраны - "тоническое" ' и частотозависимое ингибирование соответственно.

Впервые показано, что структуры, определяющие активационную и инактивационную кинетику Са²* каналов сердечной и скелетной мышц, локализованы в доменах 111 и IV ctt-субъединицы Са²* канала.

Впервые показано, что клетки линии НЕК293 (клетки почки эмбриона человека) экспрессируют эндогенные потенциалоуправляемые Са²* каналы.

Обнаружены потенциалоуправляемые Са²* каналы, свойства которых не позволяют однозначно отнести их к какому-то определенному классу согласно принятой классификации.

Впервые определена структура и локализация БТЗ и ФАА рецепторов в Са²* каналах L-типа.

Впервые показано, что взаимодействие потенциалоуправляемых Са²* каналов L-типа с ФАА и БТЗ определяется сходными, но не идентичными структурами.

Впервые показана взаимосвязь между структурами, определяющими инактивационные свойства канала, и структурами, определяющими взаимодействие Са²* антагонистов классов ФАА и БТЗ с открытым состоянием Са²* канала L-типэ.

Теоретическое и практическое значение.

Полученные данные расширяют и углубляют понимание механизмов взаимодействия Са²* антагонистов классов ФАА и БТЗ с потенциалоуправляемыми Са²* каналами L-типа как на молекулярном (взаимодействие лиганд-рецептор), так

и на макроскопическом уровне. Широкое использование Са²* антагонистов в клинической практике еще раз подчеркивает важность проделанной работы.

Подробное описание клеточной линии НЕК 293, как системы для экспрессии экзогенных потенциалоуправляемых Са²* каналов, также должно способствовать последующим исследованиям.

Данные о взаимосвязи первичной структуры со свойствами канала позволили сделать существенный шаг в понимании того, как устроен потенциалоуправляемыи Са²* канал.

Полученные результаты и наработанные методики должны оказать существенную помощь в дальнейших исследованиях свойств Са²* каналов.

Апробация работы.

Результаты диссертации доложены и обсуждены на 17 ежегодном симпозиуме по неиронаукам (Вена, 1994 г.), ежегодном симпозиуме Физиологического Общества Великобритании (Оксфорд, 1995 г.), Симпозиумах Немецкого Фармакологического Общества (1994, 1996 г.), на объединенном семинаре Кафедры физики живых систем Московского Физико-Технического Института и Лаборатории кибернетики Института хирургии им. А. В. Вишневского. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.

1. Клеточные культуры.

Клетки А7г5 были культивированы как описано в Hering et al., 1993. Клетки НЕК293 были выращены при 37С в среде DMEM (GIBCO), в присутствии 10 % фактора роста (сыворотка FBS), в атмосфере, содержащей 8 % С0₂.

2. Экспрессия экзогенных субъединиц Са¹* каналов в ооцитах Xenopus
laevis.

Самки лягушек Xenopus laevis были анестезированы в течении 15 минут в растворе MS-222 (Sandoz) непосредственно перед хирургическим извлечением частей овариев. Изолированные ооциты были очищены от фолликулярной оболочки обработкой в растворе коллагеназы (2 мг/мл) и инъецированы (объем инъекции « 50 нл) при помощи пневматического микроинжектора.

3. Транзиентная (трансмембранная) трансфенция клеток НЕК 293.

сДНК субъединиц Са²* каналов была введена в экспрессионный вектор млекопитающих pcDNA3 (Invitrogen) и, тем самым, экспрессирована под контролем CMV-промоутера. Клетки были трансфицированы "липофектаминным" методом. Стандартная трансфекция выполнялась в 35 мм чашке Петри при плотности клеток около 70%.

4. Эксперименты методом локальной фиксации потенциала.

4.1 Регистрация трансмембранных токов.

Входящие токи через потенциал-управляемые Са²* каналы регистрировались в 10 мМ растворе Si²*. Na* токи через Са²* каналы L-типа регистрировались во внеклеточном растворе, не содержащем двухвалентных ионов, в присутствии 130 мМ Na* в качестве токоперенссчика. Регистрации осуществлены при температуре 22-

7 25С в "whole-cell" конфигурации (Marty et al., 1981). Микроэлектроды с сопротивлением 1-4 МОм были вытянуты из боросиликатного ("тяжелого") стекла.

При необходимости ток утечки вычитался программно (алгоритм "шкалирования тока") или аналогово.

4.2 Смена внеклеточного раствора.

Смена внеклеточного раствора производилась с помощью микроперфузионной камеры МРС-50 (Savchenko at al., 1995).

4.3 Регистрация токов через одиночные каналы.

Для удаления вителиновой мембраны ооциты выдерживались 1 час в гипертоническом растворе, после чего мембрана удалялась механически острыми пинцетами. Токи регистрировались в конфигурации "с клеткой" ("cell attached", Hamil et al., 1981) в присутствии 90 мМ Ва^г* (рН=7.4).

5. Эксперименты методом двухэлвктродной фиксации потенциала.

Регистрации токов были осуществлены при температуре 22-25С в растворе, содержащем 40 мМ Ва²*, при рН 7,4. Сопротивление микроэлектродов было 0.3 - 2 МОм. Эндогенные Са²*-активируемые хлорные токи были подавлены инъекцией 50-100 нл 0.1 мМ раствора ВАРТА (свободная кислота). Регистрационная камера перфузировалась постоянным потоком (« 1 мл/мин.) контрольного раствора, или раствора, содержащего исследуемое вещество.

6. Дискретизация.

Ионные токи были дискретизированы с частотой 10 КГц при регистрации токов через одиночные Са²* каналы и 2 КГц в экспериментах на "whole cell", и затем фильтрованы численно с частотами 1 КГц и 0.5 КГц соответственно.

8 7. Программное обеспечение.

Данные были получены и обработаны с использованием пакета программ pCLAMP версий 5.7 и 6.0.

3. Статистика.

Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Статистическая достоверность отличия двух средних величин оценена при помощи парного или группового t-критерия Стьюдента (р < 0.05).