Введение к работе
Актуальность проблемы. За последние 3-4 года в разработке высокоинтегрированных олигонуклеотидных микрочипов произошел гигантский прогресс. Уже опубликованы данные об изготовлении олигонуклеотидных чипов, содержании до 400 000 олигонуклеотидов на поверхности менее 1.6 см2 [Wodicka L et al. 1997]. В 1996-1997 году были выпущены на рынок чипы для анализа мутаций в митохондриальной ДНК человека [Chee М et al, 1996], в гене BRCA1 [Hacia J. G, et al, 1996] гене p53 [Castellino A.M., 1997], генах протеазы и ревертазы вируса иммунодефицита человека [Lipshutz R.J., et. al, 1995]. Опубликованы данные об анализе экспрессии генома пекарских дрожжей на олигонуклеотидных чипах [Wodicka L et al. 1997] и чипах, содержащих ПЦР продукты [DeRisi J. L., et. al, 1997]. Несколько ранее сообщалось об использовании чипов для диагностики р-талассемии /Yershov G., et. al, 1996] и идентификации микроорганизмов [Guschin D. Y., et.al, 1997]. Данная работа иллюстрирует возможность применения чипов для идентификации аллелей генов главного комплекса гистосовместимости (HLA). Мы выбрали для отработки методов типирования ген DQA1 как наиболее простую модель, чтобы в дальнейшем, возможно, распространить эти методы на другие гены HLA
Цель работы. Целью данной работы является разработка
методических подходов диагностики генного полиморфизма, в
частности - типирования генов главного комплекса
гистосовместимости путем анализа нуклеотидной
последовательности гена с помощью гибридизации с олигонуклеотидной матрицей.
Научная новизна работы. Предложен набор олигонуклеотидов и алгоритм для автоматического распознавания аллелей гена HLA DQA1. Оптимизированы методики приготовления флуоресцентно-меченных проб для гибридизации: ПЦР, in vitro транскрипция, фрагментация РНК. Исследована эффективность идентификации аллелей в гомозиготных и гетерозиготных образцах ДНК пациентов методом гибридизации с олигонуклеотидными микрочипами. Научно-практическое значение работы. Титрование генов главного комплекса гистосовместимости человека, основанное на анализе нуклеотидной последовательности, необходимо при подборе пар донор-реципиент при трансплантации, для диагностики наследственных заболеваний, ассоциированных с некоторыми аллелями HLA. Анализ нуклеотидной последовательности высокополиморфных генов, к каким относятся гены HLA, с помощью стандартных диагностических методов затруднен, для него может потребоваться дорогостоящее секвенирование.
Гибридизация с олигонуклеотидными микрочипами - это более быстрый метод диагностики, дающий возможность автоматизировать процесс типирования, одновременно обрабатывать множество образцов ДНК пациентов. Данный метод позволяет надежно идентифицировать аллель HLA DQA1 и может быть рекомендован для типирования других генов HLA. Структура и объем работы.
Диссертация изложена на 80 стр., включая 2 табл., 10 рис. и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, и Выводы. Библиография включает 105 наименований. Основные результаты получены автором самостоятельно. Микроматрицы были приготовлены В. В. Чупеевой и Э. Я. Крейндлиным, анализ флуоресцентного изображения проводился совместно с Г. Крюковым.