Введение к работе
Актуальность проблемы. Необходимость создания устройств для приготовления гомогенных высокодисперсных эмульсий и липосомальных суспензий медико-биологического назначения обусловлена их возрастающей потребностью в медицине, фармакологии и биотехнологии.
На основе таких дисперсных систем интенсивно разрабатываются искусственные кровезаменители с газотранспортной функцией (КЗГФ), например, из перфторорганических соединений (ПФС), используя их свойства химической инертности и высокой газорастворимости. Штровые эмульсии для парентерального питания уже достаточно давно нашли широкое применение в практике. Липосомальные суспензии, содержащие лекарственные вещества и биологически активные соединения, позволяют создать высокоэффективные препараты с направленным транспортом этих веществ к органам. Эти и другие дисперсии медико-биологического назначения при приготовлении проходят стадию диспергирования и гомогенизации с целью получения необходимой дисперсности*', которая определяет качество продукта. Способ диспергирования и устройство его реализующее имеют определяющее значение при получении необходимой дисперсности. Оптимально реализованный процесс гомогенизации позволяет получить наиболее однородные по размерам частиц дисперсные системы, что повышает его качественные показатели. При этом конструкция гомогенизатора имеет решающее значение.
Исследование процесса приготовления эмульсий ПФС для искусственных КЗГФ позволяет ресить многие общие технологические вопросы создания дисперсных систем медико-биологического назначения, выделить и решить основные технические задачи, возникающие при создании устройства, позволяющего получать дисперсии медико-биологического назначения с необходимыми параметраки.
В 19Є6 году Clark и Gollan впервые показали возможность применения ПФС для поддержания жизни животных: мыши, помещенные в оксиге-нированный перфторбутилтетрагидрофуран (FX-80), жили около 20 часов. Затем в экспериментах с сердцем крысы они подтвердили возможность применения ПФС в качестве перфузионной среды, снабжающей орган кислородом. Однако, практическая нерастворимость ПФС в воде затрудняет использование неэмульгированных ПФС в медицине и биологии в качестве КЗГФ. Хорошо известно, что первые опыты по применению неэмуль-гированных ПФС в качестве КЗГФ были неудачными из-за гибели живот-
*) Здесь и далее под дисперсностью понимается распределение частиц эмульсий по диаметрам, которое характеризуется средним диаметром частиц (математическое ожидание), стандартным отклонением распределения и законом распределения, например, нормально-логарифмическим.
ных от эмболии - закупорки капилляров перфторсоединвниями. Поэтому почти единственно возможным физико-химическим состоянием ПФС, пригодным для медико-оиологических целей, является эмульсия ПФС.
Первые опыты по применению эмульсии ПФС в качестве КЗГФ провели в 1967 году Sloviter и Kamimoto, приготовив эмульсию на основе FX-80 со средним диаметром частиц 2-3 мкм, для перфузии изолированного мозга крысы. Дальнейшее изучение эмульсии ПФС показало, что они имели высокую токсичность, в первую очередь, из-за плохой дисперсности, т.е. из-за наличия большого количества крупных частиц ПФС и из-за наличия ионов фтора. Ионы фтора образовывались при ультразвуковом (УЗ) диспергировании ПФС как следствие чрезмерно высокого энергетического воздействия кавитации на молекулы ПФС. Кроме того было отмечено, что такие эмульсии ПФС не обладали достаточной коллоидно-химической устойчивостью и не сохранялись в течение необходимого времени.
Эмульсии ПФС, являясь дисперсными системами, с точки зрения их медико-биологической направленности должны иметь определенный диапазон размеров частиц т.к. именно дисперсность определяет потенциальную токсичность эмульсий ПФСІ Крупные частицы являются источником возникновения эмболии, а мелкие частицы непродолжительно удерживаются в кровеносном русле, проникают через стенки кровеносных сосудов в ретикулоэндотелиальную систему и остаются там на длительный срок. Дисперсность определяет и коллоидно-химическую стабильность эмульсий ПФС, необходимую при длительном хранении.
Поэтому, наряду с другими факторами, весьма актуальной является проблема получения таких эмульсий ПФС, в которых вместе с высокой кислородной емкостью, небольшой вязкостью, непродолжительным периодом полувыведения из организма и другими физико-химическими и биологическими показателями, показатели дисперсности (средний диаметр частиц и стандартное отклонение) имели определенные, технологически регулируемые параметры, которые удовлетворяли бы строгим медико--биологическим требованиям. Согласно этим требованиям максимальный диаметр частиц эмульсий ПФС должен быть не более 300-500 нм, что определяется прохождением частиц через капилляры. Вместе с тем показано, что уменьшение доли крупных частиц уменьшает реактогенность эмульсии. Наименьший размер должен быть не менее 30-40 нм, что определяется проницаемостью стенок кровеносных сосудов.
Дальнейшее совершенствование эмульсий ПФС в направлении повышения дисперсности позволила в 1968 году Geyer, Monroe и Taylor использо-
вать эмульсию ПФС для замещения почти всей крови у крыс. В 19Y6 году Naito и Yokoyama разработали эксперименталышй КЗГФ "Fluosol-DA", который сыграл в разработке проблемы значительную роль.
Однако, совершенствование эмульсий ПФС и других дисперсных систем медико-биологического назначения не сопровождалось разработкой и совершенствованием диспергаторов или гомогенизаторов, которые были взяты из смежных областей техники, например из пищевой промышленности, и, следовательно, спроектированы для других целой.
Цель настоящей работы состояла в исследовании процесса приготовления субмикронных дисперсных систем медико-биологического назначения, в частности эмульсий ПФС, методом гомогенизации при высоком давлении и в создании устройства реализующего этот процесс.
Задачи исследования.
-
Выбор и исследование способа приготовления високодисперсних систем медико-биологического назначения методом гомогенизации при высоком давлении на примере эмульсий ПФС и формулирование основных технических требований к диспергатору;
-
Разработка конструкции и создание диспергатора; изучение основных физико-химических свойств получаемых дисперсий и исследование влияния параметров диспергирования на получаемые дисперсии;
-
Разработка технологических режимов приготовления эмульсий ПФС и определение области применения созданного диспергатора;
-
Исследование влияния физико-химических свойств получаемых эмульсий ПФС на их токсичность при внутривенном введении. Положения выносимые на защиту.
-
Способ уменьшения ширины гомогенизирующей микрощели путем деформационного сближения микронеровностей контактирующих поверхностей.
-
Контактирование поверхностей в гомогенизирующем клапане по типу "конус-острая кромка" создает условия достижения максимального удельного давления для деформационного сближения микронеровностей. Установлено, что средний диаметр частиц эмульсий и липосо-мальных суспензий зависит от: а) величины угла при вершіте конической поверхности затвора контактирующей с острой кромкой седла и б) величин твердостей материалов контактирующих поверхностей.
-
Конструкция гомогенизирующего клапана обеспечивает получение субмикронных частиц дисперсных систем медико-биологического назначения со средним диаметром 50-100 нм.
-
Конструкция гомогенизирующего устройства с закрепленным в нем гомогенизирующим клапаном, обеспечивает высокое давление гомо-
генизации, необходимый температурный режим, рециркуляцию и стерильность гомогенизируемой дисперсной системы медико-оиологичес-кого назначения. Ь. Конструкция электромеханического привода гомогенизатора высокого давления позволяет плавно изменять производительность и комбинировать режимы гомогенизации дисперсий в широких пределах. 6. Установлена функциональная зависимость среднего диаметра частиц дисперсной системы от давления гомогенизации, количества циклов ' гомогенизации и температуры на примере эмульсий ПФС медико-биологического назначения.
Научная новизна. Настоящая работа является продолжением исследований процессов приготовления дисперсных систем медико-биологического назначения на примере эмульсий ПФС, и предлагает новые технические решения гомогенизирующего устройства для этих целей.
В результате реализации поставленных задач был впервые разработан и исследован гомогенизирующий клапан, позволяющий получать субмикронные дисперсии медико-биологического назначения со средним диаметром частиц от 50 до 100 нм. Получены зависимости среднего диаметра частиц от угла при вершине конической торцевой поверхности затвора клапана, которые устанавливают влияние конструктивного параметра на дисперсный состав эмульсии. Разработана оригинальная конструкция гомогенизатора высокого давления с широким диапазоном технических параметров и производительности. Исследована зависимость предельного среднего диаметра частиц эмульсий НФС от величины давления гомогенизации и от количества циклов гомогенизации, для последних получены формулы, отражающие эти зависимости. Получены зависимости концентрации ионов фтора в эмульсиях ПФС от давления и от количества циклов гомогенизации. Исследовано распределение частиц эмульсий ПФС по диаметрам на различных этапах процесса приготовления. Получены данные по влиянию среднего диаметра частиц и концентрации ионов фтора на острую токсичность эмульсий НФС при внутривенном введении их в организм животных.
Практическая значимость работы и реализация результатов исследо-ния. Настоящая работа проведена в соответствии с плановыми НИР по проблеме "Совершенствование кровезаменителей - переносчиков кислорода", утвержденными Распоряжениями АН СССР № 00219 от 4.09.85, J* 0042 от 20.02.86 и * 028 от 29.01 .88, а также по проблеме "Синтез *) количество циклов - это отношение производительности гомогенизатора Q к исходному объему V жидкого продукта: N=Q/V [сек-1];
новых фторуглеродов и поверхностно-активных веществ для создания кровезаменителей - переносчиков кислорода", утвержденными Распоряжениями АН СССР № 0042 от 20.02.86 и № 028 от 29.01.88.
Разработана оригинальная конструкция гомогенизатора высокого давления (пат. РФ № 2035855 приоритет от 06.09.89).
Разработан специальный гомогенизирующий клапан (пат. РФ JS 2021848 приоритет от 07.08.90).
Разработан и исследован способ приготовления эмульсий ПФС методом гомогенизации под высоким давлением, в результате которого предложены составы и способы приготовления кровезаменителей с газотранспортной функцией на основе ПФС (КЗГФ ПФС) - "Перфторан" и "Фторэм" (Авт. св. JG 1298976, 1984). На основании проведенных исследований и с использованием созданных методов и техники разработан лабора-торно-технологический регламент на производство КЗГФ ПФС.
Гомогенизатор высокого давления (ГВД) "Донор-I", основанный на вышеуказанных изобретениях, разработан совместно с Экспериментальным заводом научного приборостроения РАН (ЭЗНП РАН) и изготовлен опытной партией в количестве 10 экз. Он испытан в Институте биофизики клетки РАН, в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН, в Институте пищевых веществ РАН, во ВНИИ технологии кровезаменителей и гормональных препаратов Мішздравмедпрома РФ, в НИИ физико-химической медицины Минздравмедпрома РФ и в Экспериментальном предприятии медико-биологических препаратов при Кардиологическом научном центре РАМН.
ГВД "Донор-I" успешно используется в лабораторной технологии при приготовлении для исследовательских целей новых лекарственных препаратов. С помощью этих гомогенизаторов наработано свыше 3000 л различных экспериментальных эмульсий, что обеспечило реализацию широкой научно-исследовательской программы медико-биологических и технологических экспериментов при разработке КЗГФ ПФС.
Изготовлены и испытаны опытные экземпляры ГВД "Донор-2" и ГВД "Эльф-I" (Донор-3"). Оба ГВД испытаны в Институте биофизики клетки РАН. ГВД "Эльф-I" подготовлен к выпуску опытной партией в количестве 20 экз.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены на
Всесоюзной конференции "Медико-биологические аспекты применения эмульсий перфторуглеродов" в г. Пущино в 1983 г.,
на Всесоюзной конференции "Перфторорганические соединения (ПФС) в медицине. Создание газопереносящего гемокорректора на основе
эмульсий ПФС." в г. Ленинграде в 1988 г.,
на Всесоюзной конференции "Перфторуглероды и медицина" в г. Новосибирске в 1989 г.
на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы разработки и применения эмульсий дарфторуглеродов" в г. Пущино в 1990 г.
на Учредительной конференции по организации общественной межгосударственной научно-исследовательской лаборатории по проблемам применения перфторорганических соединений в медицине и биологии в Г.Пущино в 1992 Г.
на VI Симпозиуме по биохимии липидов в Г.С.Петербурге в 1994 г. Публикации. По теме диссертации опубликовано Т печатных работ.
Получено 1 авторское свидетельство СССР и 4 патента РФ, б заявок на изобретения находятся на экспертизе во ВНИИ государственной патентной экспертизы.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на & страницах машинописного текста и включает fjtjt таблиц и 41 рисунок. Диссертация состоит из введения, двух глав с обзором литературы и трех глав собственных исследований; диссертация заканчивается заключением, выводами и списком литературы, включающего наименований.
В Приложении I даны примеры использования метода гомогенизации при высоком давлении и разработанного гомогенизатора для приготовления липосомальных дисперсий и жировых эмульсий для парентерального, питания, а также некоторые примеры иного их применения (дезинтеграция микроорганизмов и др.). В Приложении 2 описаны использованные для исследований методы, материалы и устройства.