Гипохлорит и окислительная модификация липопротеинов крови человека Панасенко, Олег Михайлович

Введение к работе

Актуальность проблемы. В 80-х годах на основании ряда экспериментальных фактов

(Fogelman et al., 1980; Heinecke et al., 1984-1987; Esterbauer et al., 1987; Steinberg et al., 1981-

1988) сформировалась научная гипотеза, согласно которой липопротеины (ЛП), являющиеся

основной транспортной формой липидов в крови, претерпевают модификацию в результате

интенсификации радикальных реакций перекисного окисления липидов (ПОЛ). Такая

модификация ЛП низкой плотности (ЛНП) приводит к тому, что они эффективно поглощаются

клетками сосудистой стенки, трансформируя их в пенистые клетки, характеризующиеся

избыточным содержанием холестерина и являющиеся важным признаком ранних стадий

атеросклероза. В 1988 г. Avogaro с сотр. удалось впервые изолировать подфракцию

окисленных ЛНП из кроаи человека. Однако, причины появления окисленных ЛП в кроаи

оставались неизвестными. Среди обсуждаемых в литературе возможностей наиболее

вероятной можно считать взаимодействие натианых ЛП с активными формами кислорода

("0₂", Н₂0₂, *ОН), которые продуцируются клетками сосудистой стенки (гладкомышечными,

эндотелиальными, макрофагами) при активации (Sfeinbrecher et al., 1984-1988; Hinsbergh et

al., 1986, 1987; Heinecke et al., 1986; Parthasarathy eta!., 1986). С этой точки зрения особого

внимания заслуживают моноциты и нейтрофилы. Во-первых, их содержание в крови весьма

велико (нейтрофилов - 2,8-4,5*10 в 1 л; моноцитов - 1,3-6,0-Ю⁸ в 1 л). Во-вторых, эти клетки

> способны в результате активации фермента NADPH-оксидазы, согласно схеме,

изображенной на рис. 1, генерировать не только активные формы кислорода, но и

секретировать фермент - миелопероксидазу (МПО, донор: Н₂0₂-оксидоредуктаза, КФ

1.11.1.7.), который катализирует образование сильного окислителя - хлорноватистой кислоты

[НОСІ) или ее ионизированной формы - гипохлорит-аниона (ОСГ) по реакции (Klebanoff and

Dlark, 1978; Weiss et al„ 1982):

CI+H*+H₂0₂-»H0CI + H₂O, (1)

Эднако известно (Каган с соавт., 1986; Клебанов с.соавт., 1988), что "0₂" и Н₂0₂ являются

:лабыми окислителями и сами по себе не способны инициировать ПОЛ. 'ОН-радикал

і ряде работ ставится под сомнение (Hiramatsu etal., 1987; Janzenetal., 1987; Cohen etal.,

NAOPH аксийаза сод Миелолероксидаза

НОСІ/ОСГ

Рис. 1. Пути превращения активных форм кислорода в результате активации іейтрофилов или моноцитов (Edwards, 1994).

1988). 8 таком случае, принимая во внимание схему превращения активных форм кислоро;
представленную на рис. 1, логично предположить, что важная роль в окислении ЛП
присутствии фагоцитов может принадлежать гипохлориту. ^л

К началу работы в литературе отсутствовали данные о существовании окислитепьн деструкции ЛП крови гипохлоритом или в присутствии МПО. Однако имелись косвенні указания в пользу возможности такой модификации. Фермент МПО весьма стоек (Шафр; 1981), его содержание в нейтрофилах чрезвычайно велико: до 5% сухого веса клетки (Schi and Kaminver, 1962). Более 20% фермента стимулированные нейтрофилы секретируют внеклеточную среду (Smith et al., 1985). Около трети всего кислорода, потребляемс нейтрофилами при активации затрачивается на образование НОСІ/ОСГ (Foote et al., 198 При взаимодействии гипохлорита с Н₂0₂ образуется синглетный кислород (см. рис. 1] инициатор ПОЛ (Ргуог, 1978). Было установлено (Kettle and Winterboum, 1988), что определенных условиях "0₂" может служить наряду с Н₂0₂ субстратом для МПО. При эт образуется все тот же гипохпорит. НОСІ/ОСГ модифицирует низкомолекулярні антиоксиданты в составе ЛП (Albrich et al., 1981), а также ряд ферментов (СОД, катала глутатионпероксидазу) и белков плазмы (церулоплазмин, трансферрин), обладают антиокислительной функцией (Aruoma and Halliwell, 1987; Шаронов с соавт,, 1988-199 Внутривенное введение экспериментальным животным метионина - эффективнс перехватчика гипохлорита - в условиях активации нейтрофилов крови предотвраща аккумуляцию продуктов ПОЛ в сыворотке и сердечной ткани (Prasad et al., 1991).

Итак, совокупность экспериментальных фактов, накопившихся к концу 80-х годі позволила нам предположить возможное участие гипохлорита, продуцируемого при аетиваи нейтрофилов или моноцитов по реакции, катализируемой МПО, в окислитепьн модификации ЛП крови человека.

Цель работы: изучить механизм модификации физико-химических свой< липопротеинов крови человека гипохлоритом, выявить изменение основных биоложчес* функций у таких ЛП и определить их возможную причастность к формированию рань проявлений атеросклеротического процесса.

Для достижения поставленной цели были сформулировали следующие задачи:

1. Исследовать закономерности окисления липопротеинов клетками крс
(нейтрофилами и моноцитами) и определить возможность активации этих клеток п
взаимодействии с окисленными липопротеинами.

1. Провести всестороннее изучение модификации физико-химических свойств ЛП п их окислении гипохлоритом или в системе "миелопероксидаэа + Н_г0₂ ⁺ СР.

2. Выяснить, обладают ли ЛП, модифицированные гипохлоритом, теми свойства» которые характерны для ЛП при атеросклерозе: способностью аккумулировать холестериї клетках крови и стимулировать адгезию клеток крови к эндотелию.

3. Исследовать возможное участие нитрита в гипохлорит-индуцированном перекиси окислении липидов и в модификации ЛП гипохлоритом.

5. Исследовать кинетику и механизм реакции гипохлорита с ненасыщенными связями свободных жирных кислот и фосфолипидов.

6. На упрощенной модельной системе - фосфатидилхопиноеых липосомах - изучить механизм ПОЛ, индуцированного гипохлоритом.

Научная новизна работы, В диссертационной работе впервые подробно исследована кинетика взаимодействия гипохлерита с двойными связями свободных жирных кислот и жирнокислотных цепей фосфатмдилхолина. Показано, что основной реакцией гипохлорита с ненасыщенными жирнокиспотными цепями является электрофильное присоединение по двойной связи (по молекулярному механизму) со стехиометрическим соотношением, изменяющимся от 2 до 1 по мере увеличения общей концентрации двойных связей в липосомах и числа двойных связей в одной жирнокислотной цели. Основным продуктом зеакции является хлоргидрин. Предложен механизм взаимодействия гипохлорита с ченасыщенными связями ацильных цепей фосфолипида в липидной фазе.

Впервые продемонстрировано, что гипохлорит, который образуется при активации іейтрофилов или моноцитов по реакции, катализируемой МПО, помимо электрофипьного ірисоединения по двойной связи индуцирует в ненасыщенном липиде радикальные реакции ЮЛ. Это приводит к образованию в фосфолипидных липосомах или ЛП первичных липопероксидов, диеновых конъюгатов), вторичных (ТБК-реактивных продуктов) и конечных флуоресцирующих) продуктов ПОЛ. Исследован механизм инициирования гипохлорит->посредованного ПОЛ. Показано, что стадия инициирования ПОЛ в^; присутствии гипохлорита экзогенного или продуцируемого в системе "МПО + Н₂0₂ + СГ) может быть реализована ілагодаря его реакции с органическими гидропероксидами, всегда присутствующими в іекотором количестве в ненасыщенном липиде. В ходе этой реакции- образуются свободные іадикальї, вероятнее всего алкоксильные, являющиеся эффективными инициаторами ПОЛ.

Впервые исследована роль ионов железа в гипохлорит-индуцированном ПОЛ. 'становлено, что гипохлорит реагирует с Fe²* с бимолекулярной константой скорости 114 ± 7 ff'c'¹ (рН 7,2) с образованием свободных радикалов. Однако, ни Fe²*, ни Fe³⁺ не принимают частия в стадии инициирования гипохлорит-индуцированного ПОЛ, по крайней мере в словиях нашего эксперимента. Тем не менее, Регионы участвуют в разветвлении цепей кисления, стимулируя таким образом гипохлорит-индуцированное ПОЛ.

Изучено изменение физико-химических свойств ЛП под действием гипохлорита. Іоказано, что гипохлорит разрушает в ЛНП липидорастворимые антиокисданты: а-токоферол, эротиноиды. Это снижает резистентность ЛП к пероксидации. Сравнительный анализ оказал, что по эффективности перехватывать гипохлорит каротиноиды расположились в педующей последовательности: транс-ликопин к 5-цис-ликопин > а-каротин > р-каротин > эаксантин > а-криптоксантин > цис-2',3'-ангидролютеин > р-криптоксантин > транс-2',3'-нгидролютеин > лютеин.

С использованием метода ЭПР спиновых зондов и меток установлено, что гипохлорит, эоникая в поверхностный протеолипидный слой ЛНП, уменьшает подвижность и увеличивает

полярность ацильных цепей фосфолипидов вплоть до 12-ого С-атома, а также увеличиваї долю белка с более подвижными SH-группами. Это сопррвождается увеличение отрицательного потенциала поверхности Л П.

Показано, что нитрит - физиологический метаболит *NC\ продуцируемого клеткал крови и сосудистой стенки, реагирует с гипохлоритом с бимолекулярной константой скорое (7,4 + 1,3)-10³ M'V (рН 7,2). В ходе этой реакции образуется реактивный короткоживущі интермедиат, который эффективнее гипохлорита разрушает антиоксиданты (а-токоферол и каротин) в ЛНП; увеличивает чувствительность ЛНП к пероксидации; интенсивнее гипохлори инициирует ПОЛ в ЛНП. Помимо этого он модифицирует аполипопротеин-В, нитруя остат тирозина. Модифицированные таким образом ЛНП трансформируют макрофагальные клет в клетки, подобные пенистым.

Изменение физико-химических свойств ЛП приводит к нарушению их функцч-Предварительно окисленные ЛНП (в. результате автоокисления или под действи< гипохлорита) эффективнее транспортируют холестерин в клетки, как содержащие (моноцит макрофаги), так и не содержащие (эритроциты) специфические рецепторы к Л Пероксидация лишает ЛВП холестерин-акцепторной функции. Оба факта способствуї аккумуляции холестерина в клетках.

Гипохлорит в физиологических концентрациях стимулирует адгезию эритроцитов монослою эндотелиальных клеток и вызывает аккумуляцию холестерина е эндотелиоцит; воздействуя на эндотелий непосредственно или опосредованно через модификацию ЛНП.

ЛП, модифицированные гипохлоритом или в результате автоокисления, вызыва: активацию моноцитов и нейтрофилоз, способствуя дополнительному образован! инициаторов свободнорадикальных реакций (в том числе гипохлорита), а значит дальнейшей интенсификации реакций ПОЛ.

Практическая значимость работы. Работа является фундаментальні исследованием. Тем не менее, отдельные ее положения имеют прямое практическ приложение. Так, было установлено, что диета, одновременно обогащенн липидорастворимым (а-токоферол) и водорастворимым (карнозин) антиоксидантам обладает выраженным гипохолестеринэмическим эффектом при экспериментальн атеросклерозе, уменьшает степень поражения аорты, способствует снижению урое продуктов ПОЛ не только в сыворотке и апо-8-содержащих ЛП, но и предотвращу окисление последних на стадии синтеза в печени и может быть рекомендована д профилактики и лечения атеросклероза.

Экспериментальное обоснование участия гипохлорита,. образующегося в организ при активации нейтрофилов и моноцитов, в модификации физико-химических свойств крови, нарушении их функции и, как следствие, в формировании ранних стадий атеросклер< вносит существенный вклад в понимание теории атерогенеза, разработку ереді профилактики и лечения этого заболевания. Полученные в работе данные слу> теоретическим обоснованием использования антиоксидантов, перехватчиков гипохлорит;

ингибиторов МПО на определенных стадиях развития атеросклероза, а также других заболеваний, где активированные нейтрофилы и иные источники МПО играют существенную роль (ревматоидный артрит, воспалительные процессы и др.).

Показано, что ликопин, до сих пор известный как самый эффективный из каротиноидов тушитель синглетного кислорода, перехватчик свободных радикалов и ингибитор ПОЛ, оказался и наиболее эффективным перехватчиком гипохлорита и, исходя из этого, может быть рекомендован в качестве основы для создания нового класса антиокислительных фармакологических препаратов.

Использованные в работе модельные системы: изолированные нейтрофилы, "МПО + Н_г0₂ + СГ" или гипохлорит могут быть рекомендованы для внедрения в практику с целью разработки тестов, направленных на скрининг потенциальных перехватчиков гипохлорита или ингибиторов МПО.

Разработанный в диссертации методический подход регистрации остаточной концентрации гипохлорита по хемилюминесценции люминола может быть применен для изучения кинетических закономерностей реакций гипохлорита с другими физиологически важными молекулами или белок-липидными комплексами.

Продукты реакции гипохлорита с ненасыщенными липидами (хлоргидрины гликолей), образующиеся in vivo, могут быть использованы в диагностических и прикладных биохимических исследованиях в качестве маркеров модификации липидной фазы ЛП и биомембран гипохлоритом. Их регистрация в ЛП или сосудистой стенке может послужить дополнительным критерием в диагностике ранних стадий атеросклероза.

В последнее время гипохлорит, полученный электрохимическим путем, используется внутривенно в клинике в качестве бактерицидного и детоксицирующего агента при перитонитах, остром панкреатите, тяжелых ожогах, отравлениях и других патологиях (Сергиенко с соавт., 1985-1995). Результаты проведенного в работе всестороннего исследования механизма взаимодействия гипохлорита с ЛП послужили теоретической основой оптимизации применения на практике метода непрямого электрохимического окисления крови. Отдельные разделы диссертации вошли как составная часть в работу: 'Разработка и внедрение электрохимических методов детоксикации в медицине", удостоенную з 1996 г. премии Правительства Российской Федерации.

Некоторые разделы работы используются в учебном процессе на медико-эиологическом факультете РГМУ им. Н.И. Пирогова и на факультете фундаментальной иедицины МГУ им. М.В. Ломоносова, вошли в монографии Владимирова Ю.А. с соавт. Свободные радикалы в живых системах" (ВИНИТИ, Москва, 1991) и Жданова Р.И., Комарова \.М. "Модельные и биологические мембраны в методе спиновых меток и зондов" (ВИНИТИ, Иосква, 1989) и могут быть использованы в научных исследованиях, проводимых в институтах эиохимического, биофизического, токсикологического и медико-биологического профиля.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: 4-м Всесоюзном :импозиуме по биохимии пипидов (Киев, 1983); 4-й Международной конференции

"Применение ЭПР-спектроскопии в молекулярной биологии и медицине" (Эберсвал! Германия, 1984); Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медщт (Звенигород, 1985, 1989, 1990, 1996; Одесса, 1986); 4-й Всесоюзной конференции патологии клетки (Москва, 1987); конференции научно-координационного совещан экспертов стран-членов СЭВ и СФРЮ "Биофизика мембран. Прикладные аспекты" (Моем 1987); 6-м Международном симпозиуме "ЭПР-спектроскопия в биохимии, молекулярн биологии и медицине" (Братислава, Словакия, 1988); заседании Координационного Сове проблемного научного центра по физико-химической медицине, биофизике и иммунолог (Конаково, 1988); Всесоюзной конференции "Кислородные радикалы в химии, биологии медицине" (Юрмала, 1989; Минск, 1992; Киев, 1995); Международной конференции нигроксильным радикалам (Новосибирск, 1989); 3-й Всесоюзной конференц "Биоантиоксидант" (Москва, 1989); 4-м Всесоюзном съезде патофизиологов (Кишинев, 198 5-м Конгрессе Международного свободнорадикального научного общества (Пасадеї Калифорния, США, 1990); Всемирном конгрессе патофизиологов (Москва, 199 Международном симпозиуме "Кислородные радикалы" (Санкт-Петербург, 1991); Всесоюзн конференции "Электрохимические методы в медицине" (Дагомыс, 1991); Международн конференции по критическим аспектам свободных радикалов в химии, биохимии и медици (Вена, Австрия, 1993); 1- и 2-й Международных конференциях по клиническ хемилюминесценции (Берлин, Германия, 1994, 1996); 8-м Международном симпозиу "Липопротеины и атеросклероз" (Дрезден, Германия, 1994); 5-, 6- 7- и 9-й Международн конференциях по липидам (Лейпциг, Германия, 1994, 1995, 1996, 1998); Международн конференции "Свободные радикалы в норме и патологии" (Киев, 1995); Европейском съез клеточных биологов (Гайдельберг, Германия, 1995); симпозиуме "Липопротеины атеросклероз" (Санкт-Петербург, 1995); Международной конференции "Окислительный стреї Молекулярные механизмы и патофизиологические последствия окислительного поврежден мембран и липопротеинов" (Грац, Австрия, 1996); ежегодном съезде цитологов Герман (Галле, Германия, 1997); сьезде общества биохимиков и молекулярных биологоа Герман (Тюбинген, Германия, 1997); Международной конференции Типохлорит - метабог нейтрофилов" (Лейпциг, Германия, 1998); Международной конференции "Пероксида: биохимические и клинические аспекты" (Фрауенхимзее, Германия, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 72 научные работы центральных академических, медицинских и международных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзе
литературы, главы "Материалы и методы", трех глав с результатами эксперимент!
заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на ст

содержит 28 таблиц, проиллюстрирована 137 рисунками и схемами. Библиография включг 423 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов.