Гидратация и структурные переходы нуклеиновых кислот в конденсированном состоянии Семенов, Михаил Алексеевич

Введение к работе

Актуальность проблемы. Проблема гидратации нуклеиновых кислот а последние десять лет приобрела особую актуальность в молекулярной биофизике, поскольку стало очевидным, что без знания детальных механизмов взаимодействия биомакромолекул с их гидрат-но-ионным окружением нельзя понять физико-химические закономерности, определяющие свойства и функционирование биополимеров. В связи с этим в настоящее время проводятся интенсивные экспериментальные и теоретические исследования такого взаимодействия для нуклеиновых кислот разного уровня организации с целью выявления влияния растворителя (воды) и ионов на структуру, стабильность, структурные переходы и конформационную подвижность ДНК, РНК, по-линухлеотидов и других биополимеров нуклеиновой природы.

В последние годы методами структурного анализа достигнуты определенные успехи в исследовании расположения воды и противо-ионов вблизи олигомерных молекул нуклеиновых кислот. Однако, имеющиеся экспериментальные данные и результаты теоретического рассмотрения пока еще недостаточны для понимания полной картины взаимодействия полимерных нуклеиновых кислот с водой, ионами, лигандами, а также механизмов их влияния на структурные переходы, стабильность и подвижность ДНК. Успешное решение этих вопросов, сьизанных с проблемой гидратации, во многом определяется разработкой весьма чувствительных физических экспериментальных мето-дэь, позволяющих выявить тонкие эффекты взаимодействия воды с биомолекулами.

аврспективным в этом плане является сочетание нескольких экспериментальных методов - инфракрасной спектроскопии, пьезограви-метрии, микрокалориметрии, диэлектрометрии, а также теоретических расчетов. Применение такого комбинированного подхода дает возможность охарактеризовать структурные и термодинамические свойства конденсированного состояния нуклеиновых кислот, физическое состояние растворителя, учесть вклад воды в стабильность биомолекул. Кроме того, обнаружение и характеристика особенностей структурных периодов нуклеиновых кислот с малым содержанием воды в присутствии лигандов (БАВ, белков) позволяет связать эти переходы с функциональными особенностями биополимеров и выяснить молекулярные механизмы взаимодействия.

Цель и задачи исследования. Содержание настоящей работы эк-

епериментальное исследование связи спектроскопических и термодинамических свойств нуклеиновых кислот различного уровня организации с их структурой и гидратацией в широком интервале температур (100-400К) с целью выяснения структуры и энергетики гидратного окружения ДНК.

В задачу работы входило:

1. Разработка комплексного подхода исследования пленок нуклеиновых кислот, включающего: а) создание прецизионного метода (кварцевого резонатора) получения изотерм гидратации НК при различных температурах; б) разработка методик выращивания пленок нуклеотидов, полинуклеотидов, ДНК и комплексов ДНК с яигандами; в) получение ИК-спектров пленок в области поглощения азотистых оснований, сахаро-фосфатных групп и сорбированной воды в широком диапазоне температур (100-400Ю и относительных власностей.

2. ИК-спектроскопическое исследование гидратации и структурного состояния нуклеотидов, полинуклеотидов, ДНК и ее комплексов с БАВ и белками.

3. Теоретическое обоснование спектроскопического проявления гидратации и структурных переходов нуклеотидов и полинуклеотидов на основании квантово-химических расчетов и использования представлений молекулярной теории зкситонов.

4. Определение структурного состояния нуклеиновых кислот различного уровня организации при конфорыационныт переходах,

а также центров гидратации и степени их заполнения молекулами воды.

5. Получение термодинамических параметров гидратации нуклеотидов, полинуклеотидов и ДНК с помощью изотерм гидратации и модельных представлений о процессе адсорбции воды, ИК-спек-троскопических данных о поведении Н-связей и микрокалориметрических измерений теплот десорбции.

6. Определение энергетики гидратации двухспиральннх полинуклеотидов и ДНК.

7. Детальная характеристика гидратации нуклеиновых кислот и выяснение молекулярных механизмов взаимодействия молекул растворителя с их.конкретными структурами. Оценка вклада воды в стабилизации спиральных структур нуклеиновых кислот.

8. Определение состояния воды в гидратной оболочке ДЧК и анализ динамики ее структурных переходов.

9. Выяснение возможностей практического кспользовчн;^ предло-

женного комплексного подхода изучения нуклеиновых кислот и их комплексов с биологически активными веществами и белками в конденсированном состоянии.

Научное значение и новизна. В работе впервые

получены спектры увлажненных мононуклеотидов. Обнаруженные высокочастотные сдвиги и ИК-птохромизм связаны с образованием "стопок" азотистых оснований;

показано, что в водном растворе энергетически выгоднее формирование гидратных комплексов азотистых оснований, чем водсродно-связанных уотсон-криковских пар;

с помочью определенных спектральных параметров полос поглощения азотистых оснований расшифрована тонкая структура и выполнено корректное отнесение коьтонент карбонильного поглощения для большой группы одно-и двухспиральных полинуклеэтндов и в некоторых случаях уточнены детали их структуры;

получены изотермы гидратации и определены степени гидратации клубкових и спиральных форм полинуклеотидов. На основании этих данных к анализа спектроскопических свойств еорй'ированнэ'й воды определены термодинамические параметры гидратации и оценен вклад гидратной оболочки в стабилизацию Л—:>зркы ДНК;

- на основании квантово-химичееких- расчетов электронной плотности нуклеотидов качественно объяснена природа обнаруженных- низкочастотных сдвигов и эффект возрастания интенсивности ИК-полос поглощения нуклеиновых кислот при низкой степени их гидратации;

- анализ статистико-механических моделей изотерм гидратации,
спектральных параметров полос поглощения азотистых основа
ний, сах&ро-фосфатного остова и сорбированной воды дал
возможность выявить значительные различия по энергии связы
вания молекул воды в гидратноП оболочке ДКК. Знание энер
гетики гидратации ДНЯ позволило оценить вклад молекул воды
в стабилмозгчш ее 3-формы;

-показана реяаотак роль воды г динамике структурных переводов ДНК (тїіііа. Р-*А-форма, А-*5~ Форла), а также установить, что теплосая денатурация ДНК сопровождается двустадийным разрушекл-;м се гкдратной оболочки. В совокупности все эти данные пег волили по-новсму взглянуть на процессы "гидрата-

ционных" и тепловых структурных переходов ДНК в конденсированном состоянии и существенно уточнить их молекулярный механизм;

- разработанный подход был применен для изучения влияния гидратации на комплексообразование нуклеиновых кислот с БАВ и белками в конденсированном состоянии.

Практическая ценность. Практическая значимость науиныг результатов заключается в том, что выявлены основные закономерности гидратации, влияния температуры и др. внешних факторов на структуру и стабильность нуклеиновых кислот разного уровня организации в конденсированном состоянии. Это позволило углубить существующие представления о стабилизирующей роли воды в построении спиральных структур природных нуклеиновых кислот и создать предпосылки для целенаправленного воздействия на структуру и функции ДНК.

Результаты настоящей работы могут быть применены в различных областях биологии, медицини и химии. Прежде всего они представляют интерес для фармакологии и криобиологии при расшифровке молекулярных механизмов повреждения органов и тканей при воздействии низких температур и биологически активных веществ. Исследование белково-нуклеинэвых комплексов позволяет выработать научные рекомендации для выбора оптимальных технологических условий крио-консервации и хранения генома. Некоторые технические разработки могут быть использованы в других научно-исследовательских учреждениях АН CCCF.

Публикации. Основные результаты диссертации представлены в 59 печатных работах, включащих 18 статей в отечественных изданиях и 7 статей в международных журналах.

Апробация. Основные результаты работы обсуждались на ІУ Международном биофизическом конгрессе (Москва, Т972), на Іой , П-ой, Ш-ей, ІУ-ой, У-ой и УІ Всесоюзных конференциях го спектроскопии биополимеров (Харьков, 1971,1974, 1977,Т98І, 1984, 1988), на 1У-ом и УІ-ом Всесоюзных совещаниях по конформационныы изменениям биополимеров в растворах (Тбилиси, 1975,1985), на Всесоюзной конференции по механизмам радиационного поражения и восстановления нуклеиновых кислот (Пущино,1980), на Международном симпозиуме по биофизике нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов (Таллин, 1981), на УІ Республиканской школе-семинаре по спектроскопии молекул и

кристаллов (Чернигов, 1983), на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на рабочем,совещании по гидратации биологических соединений (Пущино,1983), на Международном симпозиуме по физико-химическим свойствам биополимеров в растворе и клетках (Пущино, 1985), на-Международннх конференциях по квантовой химии, биологии и фармакологии (Будапешт, 1986, Загреб 1988)., на ХУШ и XIX Европейских» конгрессах по молекулярной спектроскопии ЧАмстердам, 1987, Дрезден,'1989), на Ш симпозиуме по равновесной динамике и структуре биополимеров (Пущино, 1987), на Международном симпозиуме по гидратации биополимеров (Пущино, 1988), на Международном симпозиуме по физико-химии ДНК и молекулярным механизмам функционирования генома (Тбилиси, 1987), на Международной конференции "Достижения и перспективы развития криобиологии и криомедицины" (Харьков,1988).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,б глав, приложения к ІУ главе, выводов и списка литературы. Во введении сформулирована научная проблема и обосновывается актуальность исследования, перечислены основные задачи работы, указана новизна и ценность работы, даны сведения об апробации работы. 1-ая глава содержит обзор литературы, где анализируется современное состояние исследований гидратации, структуры нуклеиновых кислот и физических факторов,определяющих их стабильность, указываются нерешенные вопросы и обосновывается постановка задачи. Во Пюй главе дано описание возможностей основных методов исследования и материалов, указано программное обеспечение численной обработки экспериментальных результатов и теоретических расчетов. В Ш-ей главе приведены данные о гидратации нуклеоти-дов, полученные на основании ИК-спектроскопических данных и диэлектрических измерений. В 1У-ой главе изучены особенности гидратации полирибонуклеотидов, рассмотрено поэтапное образование одно- и двухспиральных структур в процессе гидратации полімуклеотидов, дано теоретическое описание связи тонкой структуры полосы карбонильного поглощения с конформацией нуклеиновых кислот. В У-ой главе рассмотрено поэтапное формирование А - и В-фора ДНК и ее.гидратной оболочки в конденсированном состоянии в процессе гидратации,приведены результаты определе-. ния энергетических параметров гидратации ДНК и оценен вклад воды и других факторов в стабилизащго спиральной структуры. В

.5 '

У1-ой главе проанализировано влияние внешних факторов на гидратацию и структурные переходы ДНК.

На защиту выносятся:

1. Развитие комбинированного подхода, включающего .методы ИК-спектроскопии, пьезогравиметрии и в некоторых случаях микрокалориметрии в приложении к изучению гидратации нуклеиновых кислот разного уровня организации и их комплексов с БАВ и белкакя в конденсированном состоянии.

2. Данные ИК-спектроскопического исследования гидратации нуклеотидов в аморфном и кристаллическом состояниях, а также результаты квантовохимических расчетов влияния гидратации и про-тивоионов на распределение электронной плотности и порядков связей на азотистых основаниях исахаро-фосфатных группах нуклеотидов. і

3. Вывод об энергетической предпочтительности образования в водных растворах гидратных комплексов азотистых оснований по сравнению с уотсон-криковскими парами.

4. Результаты ИК-спектроскопического и пьезогравиметричзско-го исследования гидратации и обнаруженных структурных переходов полинуклеотидов во влажных пленках; а также полученные на основании расчета резонансных частот результаты расшифровки тонкой структуры полос поглощения внутри- и внекольцевых колебаний азотистых оснований и деталей структуры некоторых полинуклеотидов.

5. "Контурный" метод расчета вторичной структуры транспортных РЖ и углов поворота азотистых оснований в спиральных участках на основе анализа абсолютных интенсивностей полос поглощения карбонильных колебаний и их' резонансных частот.

6. Метод расчета энтальпийного вклада молекул воды, стэкинг-
взаимодействия и Н-связей в стабилизацию спиральной структуры
полинуклеотида.

7_? Результаты расчета энергий гидратации азотистых оснований и сахаро-фосфатных групп полинуклеотидов на основании полученных пьезогравиметрических изотерм и Д'Арси-Ваттовской модели адсорбции.

8. Результаты исследования температурной зависимости гидратации и структуры ДНК во влажных пленках; вывод о том, что разрушение верхних слоев гидратноЯ оболочки, примыкающих к сахаро-Фосфат-ному остову,происходит в рамках двойной спирали ДНК, которая разрушается при более высоких температурах вместе с нижними слоями

гидратной оболочки.

9. Вывод об одновременной гидратации при низких относитель
ных власностях азотистых оснований и сахаро-фосфатного остова
ДНК.

10. Динамика молекулярного механизма структурных переходов ДНК при гидратации в конденсированном состоянии.

11. Вывод о существенном вкладе молекул воды в стабилизация спиральной структуры ДНК.

12. Результаты ИК-спектроскопического и пьезогравиметрическо-го изучения влияния воды на комплексообразование ДНК-этидий бромид, ДНК-кофеин и ДНК-белок.