Введение к работе
Актуальность темы диссертации. Эритроциты представляют удобный и широко используемый объект исследований мембранной биофизики. Кроме того, являясь составной частью крови, они несут информацию о патологических изменениях в организме и их часто используют для диагностики ряда заболеваний. Важным параметром, характеризующим структурное состояние эритроцитов, является их устойчивость к гемолизу, индуцированному различными факторами (теплом, светом, изменением ионной силы и рН среды, добавлением химических агентов и др.). Особое место среди всех видов гемолитических воздействий занимает гемолиз ам-фифильными веществами и, в частности, детергентами. Эти вещества обладают ярко выраженным мембранотропным действием на клетку, их также используют для обеззараживания плазмы крови от липид-окутанных вирусов, в том числе вируса иммунодефицита человека [Horowitz, 1992]. Вместе с тем механизм гемолиза этими веществами остается невыясненым и в отличие от осмотического и коллоидно-осмотического механизмов его часто пазывают "детергенто-подобньгм" [Rowe, Welch, 1994]. Такая классификация только запутывает картину, поскольку недавние исследования [BielawsJri, 1990] подтвердили уже частично забытые данные JRideal, Taylor, 1957; 1958], что детергенты в зависимости от их концентрации (в домицел-лярной области) могут вызывать два различающихся по механизму вида гемолиза.
Связь работы с крупными научными программами, темами. Различные этапы этой работы выполнялись в рамках Республиканской программы фундаментальных исследований по теме: "Изучение молекулярных механизмов старения эритроцитов" (Регуляция 05), Государственной программы фундаментальных исследований по теме: "Изучение механизмов окислительного повреждения мембран клеток крови" (Функционирование биосистем 25), а также гранта для молодых ученых М96-005 Белорусского республиканской фонда фундаментальных исследований Республики Беларусь по теме: "Везіпсулярно-гемолитические эффекты под воздействием детергента Na-додецилсульфата".
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было выяснить механизмы гемолиза детергентами, а также установить связь между параметрами гемолиза и структурно-функцноналыгым состоянием мембран эритроцитов. Поставленная цель включала решение следующих задач:
изучить параметры (процент и скорость) быстрого и медленного гемолиза Эритроцитов двумя детергентами: анионным Ма-додецичсулъфятсг.г неионным тритоном Х-100 в различных условиях (при изменении температуры и концентрации гемолитика, а также при добавлении в среду одно- и двухвалептных катионов);
оценить размеры пор, ответственных за быстрый и медленный гемолиз указанными детергентами;
установить причину гетерогенности эритроцитов в популяции по отношению к быстрому гемолизу Na-додецилсульфатом, а также вьмснить, является ли данный процесс по своей природе коллоидно-осмотическим;
- выявить возможность использования параметров гемолиза Na-додецилсуль-фатом для оценки структурно-функционального состояния мембран эритроцитов.
Научная новизна полученных результатов. Показано, что в зависимости от концентрации тритона Х-100 в мембране эритроцитов могут образовываться 3 вида пор, характеризуемых различным количеством молекул гемолитика, необходимых для образования одной поры (с кажущимися порядками реакции гемолиза п=3-5; п=11-12;и=9-10).
Получены доказательства в пользу того, что поры, ответственные за быстрый гемолиз Na-додецилсульфатом (п=3-4), образуются с участием фосфатидилхолина.
Показано, что поры, ответственные за быстрый и медленный гемолиз детергентами, обладают сходными свойствами: их проницаемость меняется аналогичным образом при добавлении в среду одно- и двухвалентных катионов (Na+, Zn2+), а величины энергий активации соответствующих гемолитических процессов имеют близкие значения.
Установлено, что диаметр пор, ответственных за медленный гемолиз детергентами, составляет около 35 А, а размер пор, соответствующих быстрому гемолизу Na-додецилсульфатом, гораздо больше этой величины.
Обнаружен необычный эффект осмотических протекторов, заточающийся в шігибировании образования крупных пор.
Показано, что детергент-индуцируемая везикуляция является процессом, конкурирующим с образованием пор, а быстрый гемолиз Na-додецилсульфатом отбирает эритроциты по их способности к везикуляции.
Установлено, что механизм быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом является не коллоидно-осмотическим; дана схема процессов, участвующих в гемолизе детергентами.
Предложен чувствительный метод оценки структурно-функционального состояния мембран по параметрам быстрого гемолиза Na-додецилсульфатом.
Практическая значимость получеппых результатов. Полученные в работе данные значительно расширяют и углубляют существующие в настоящее время представления о гемолизе эритроцитов детергентами, а также демонстрируют возможность применения последнего в медико-биологических исследованиях в качестве простого и удобного метода оценки структурно-функционального состояния мембран данных клеток. Быстрый гемолиз Na-додецилсульфатом может быть использован для разработки новых экспресс-способов диагностики функциональных сдвигов в организме.
Основные положения диссертации, выносимые па защиту.
-
Различные виды гемолиза эритроцитов детергентами в домицеллярных концентрациях обусловлены образованием сходных по своим свойствам, но различающихся по размеру пор, возникающих в разных лигшдных областях мембраны.
-
Медленный гемолиз детергентами протекает по коллоидно-осмотическому механизму, а быстрый гемолиз Na-додецилсульфатом обусловлен образованием в
мембране пор, достаточно больших для выхода через госс гемоглобина.
-
Существенное влияние на параметры быстрого гемолиза оказывает детер-гент-индуцироваїшая везикуляция эритроцитов. Являясь процессом, конкурирующим с процессом образования пор, она защищает эритроциты от гемолиза я определяет их различную устойчивость к быстрому гемолизу детергентом.
-
Широко используемый в мембранологии для оценки размера пор метод осмотических ингибиторов малоприменим в случаях быстропротекающего гемолиза амфифилышми веществами, поскольку ингибиторы сами влияют на скорость процессов, приводящих к лизису клеток.
Личный вклад соискателя. Экспериментальный материал получен автором самостоятельно. Выбор условий эксперимента, интерпретация результатов и анализ полученных данных проведены при решающем участии автора.
Апробация результатов диссертации. Результаты диссертационной работы были представлены на 1-ом и 11-ом Съездах белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 22-23 ноября 1994; Минск, 25-27 июня 1996).
Опубликоваиность результатов. По теме диссертации опубликовано 8 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 4-х глав, включающих: обзор литературы; материалы, объекты и методы исследования; результаты и их обсуждение (2 главы); выводов. Список цитируемой литературы включает 175 источников. Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 5 таблиц и 33 рисунка.