Введение к работе
Актуальность проблемы 3
Цель и задачи исследования 5
Научная новизна _ 6
Научно-практическая значимость работы 6
Апробация работы 7
Публикации 8
Методические аспекти раобты 8
Часть I. РОЛЬ Са2+ В ФУНКЦИОНИРОВАНИИ ВОДОРАЗЛАГАЮ-
ЩЕГО КОМПЛЕКСА ФС2 9
1.1. Действие блокаторов кальциевых каналов на электрон-транс
портную цепь ФС2 в тилаколдных мембранах 10
Влияние блокаторов кальциевых каналов на электрон-транспортную цепь в тшакоидных мембранах 10
Локализация }частка ингибирования электрон-транспортной цепи блокаторами кальциевых каналов 12
Факторы, модулирующие взаимодействие блокаторов кальциевых каналов с кислород-выделяющим комплексом 12
Заключение 14
1.2. Действие локальных анестетиков на электрон-транспортную цепь
тилакоидных мембран 14
Влияние локальных анестетиков па электронный транспорт в тилакоидных мембранах і 5
Идентификация участка ингибирования локальными анестетиками электрон-транспортной цепи в хлоропчастах 16
Совместное действие анестетиков и блокаторов па ЭТЦ в
ФС2 18
- Взаимодействие дикаина с бактериородопсином в пурпурных
мембранах 20
1.3. Функциональная роль Са2+ в системе фотолиза воды 22
Часть II. Са2+ -ЗАВИСИМЫЙ УЧАСТОК ТРАНСПОРТА ЭЛЕКТРОНА НА
АКЦЕПТОРНОЙ СТОРОНЕ ФС2 24
11.1. Ингибирование акцепторного участка ФС2 в ТМ при рН-зависи-
мой экстракции кальция 27
- Локализация кальций-зависимого участка инактивации ЭТЦ в
ТМ 28
- Исследование природы лигандов, участвующих в связывании
Са2+ 30
11.2. Сравнительный анализ влияния рН-зависимой экстракции
кальция из мембранных препаратов ФС2 и из ТМ на транспорт
электронов и связанные процессы З!
Экстракция кальция из мембранных препаратов ФС2 и ТМ 31
Влияние света на кальций-зависимую реактивацию ЭТЦ в препаратах ФС2 и ТМ 31
Зависимость реактивации Э ТЦ в препаратах ФС2 и ТМ
от концентрации кальция 32
- Уровень электрон-транспортной активности реактивиро
ванных препаратов в присутствиии различных акцепторов 32
Км для кальций-связывающего участка в препаратах ФС2 и ТМ 32
Кинетика индукции флуоресценции в препаратах ФС2 и ТМ до
и после кальций зависимой реактивации ЭТЦ 33
П.З. Заключение 35
Часть III. ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ МАРГАНЦЕВОГО КЛАСТЕРА В КИСЛОРОД-
ВЫДЕЛЯЮЩЕМ КОМПЛЕКСЕ ФС2 37
III. I. Связывание катионов железа с марганец-связывающим центром
вФС2 ----- 39
- Взаимодействие катионов Mn(ll), Fe'(H) и Fe(III)
с Мп-связывающим участком 40
- Влияние анионов на связывание катионов металлов с Мп-
связывающим участком 41
- Прочность связывания катионов железа с Мп-связыва-
><[Щим участком и их редокс состояние в связанном положении 41
- Влияние восстановителей па взаимодействие Fe(U)
'; Мп-связывающим участком 43
Влияние света на связывание Fe(ll) с Мп-связывающим участком 44
Кинетический анализ механизма связывания Fe(Il) с Мп-связывающим участком 46
- Заключение А1
III.2. Замещение марганца в каталитическом центре КВК
на мессбауеровский изотоп железа (^Fe) и мессбауеровские
спектры полученных при замещении препаратов ФС2 49
Связывание катионов Fe(ll) и Fe(lll) с мембранными компонентами фотосистемы помимо Мп-связывающего участка 49
Мессбауеровские спектры "специфически " и "неспецифически" связанных катионов железа в препаратах ФС2(-Мп) 49
Ш. 3. Мсдель координационной сферы марганцевого кластера
в КВК 52
Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков DI и D2 и двухъядерных железо-содержащих белков 52
координационная сфера двухъядерного марганцевого центра, вхоиящего в состав четырехъядерного марганцевого кластера КВК, 55
Часть IV. ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 58
Актуальность проблемы. Одним из важнейших элементов фотосинтетического аппарата, осуществляющего конверсию солнечной энергии, является макромолекулярный комплекс "фотосистема 2" (ФС2). Трансформация" энергии света в энергию химических связей высокоэнергетических соединений сопряжена с окислением фотосистемой 2 воды , являющейся источником протонов и электронов для последующих фотосинтетических реакций, а также молекулярного кислорода, играющего ключевую роль в жизнедеятельности подавляющего числа организмов на Земле. ФС2 представляет собой одну из наиболее важных, сложно организованных и широко распространенных природных систем. Однако, структурная и функциональная организация этого комплекса все еще недостаточно выяснена, хотя многие годы интенсивно исследуется с применением новейших теоретических и методических подходов.
В нашей работе мы сосредоточили свое внимание на выяснении структурной и функциональной роли важнейших катионов, кальция и марганца, входящих в состав этого макромолекулярного комплекса. Интерес к этим ионам обусловлен тем, что во многих биологических системах ноны металлов играют важную и разнообразную роль - структурную, каталитическую, регуляторную, транспортную и т. д.. Так, марганец и кальций входят в состав многих важных белков. В некоторых из них марганец играет структурную роль как, например, в пируваткарбоксилазе или конканавалнне А, но в подавляющем числе известных Мп-содержащих ферментов марганец функционирует как каталитический центр, в котором используются его окислительно-восстановительные свойства. Большая часть Мп-содержащих ферментов участвует в метаболизме кислорода, осуществляя активацию кислорода в каталитическом цикле ( марганец-содержащая рибонуклеотид редуктаза) или дезактивацию его активных форм (супероксиддисмутаза, пероксидаза, бактериальная каталаза). Эти ферменты содержат либо один атом марганца (супероксиддисмутаза), либо двухъядерный кластер (бактериальная рибонуклеотидредуктаза, аргиназа, тиосульфатоксидаза, пероксидаза, бактериальная каталаза). Кислород-выделяющий комплекс ФС2 оксигенных организмов (высших растений, водорослей и цианобактерий), является наиболее распространенным и важным представителем класса Мп-содержащих
ферментов. Марганцевый кластер в КВК организован наиболее сложно. Он состоит из 4-х атомов марганца, последовательность редокс-переходов которых обеспечивает его каталитическую функцию. При поглощении света реакционным центром марганцевый кластер аккумулирует четыре окислительных эквивалента, требующихся для генерации молекулы кислорода, при этом каждой стадии окисления соответствует определенное редокс-состояние кластера - S-цикл (Кок и г;р., 1970). Кислород выделяется при переходе кластера из S3 в S0 с промежуточным состоянием S4. В1 настоящее время накоплена обширная информация об этом кластере, касающаяся главным образом его состава и окислительно-восстановительных переходов, сопровождающих процесс поглощения света. В тоже время, многие аспекты структурно-функциональной организации марганцевого каталитического центра КВК изучены в значительно меньшей степени. К числу важнейших, но мало исследованных проблем, имеющих исключительно важное значение для выяснения механизма фотолиза воды, относятся локализация марганцевого центра в ФС2, структура марганцевого кластера, природа лигандов, связывающих ионы марганца. В последнее время исследования этих проблем начинают интенсивно развиваться. Так, на основе данных EXAFS-измерений предложена модель двухдимерной структуры марганцевого кластера (Sauer et al., 1992); с использованием функциональных тестов (Preston, SeitKrt, 1991; Blubaugh, Cheniae, 1992) и спектроскопических методов (Tang et al., 1994) получены свидетельства в пользу участия карбоксильных групп аминокислот и гистидиновых остатков в связывании марганца. Возможность функционирования некоторых аминокислотных остатков в качестве лигандов марганца начинает активно изучаться с применением метода точечного мутагенеза (Vermaas, 1993). Однако, имеющейся информации по этим вопросам явно недостаточно и, учитывая их большую важность для расшифровки механизма фотолиза воды, требуется проведение дальнейших интенсивных исследований в данном направлении.
Ионы кальция играют важную регуляторную роль во многих биологических процессах, таких, например, как мышечное сокращение, выделение нейротрансмиттеров, гормональные реакции и др., выступая в качестве внутриклеточного мессенджера в передаче регуляторной информации. Функциональная активность этого катиона реализуется, как правило, через взаимодействие с кальций-связываюшими белками. В кальций-содержащих белках кальций может играть структурную роль, обеспечивая определенную
конформацию белка, которая либо является необходимой для проявления каталитической активности (фосфолипаза А2), либо повышает его термоустойчивость, как, например, в териолизине или предотвращает автолиз белка (трипсин). Однако, важнейшей физиологической функцией кальция является регуляторная, реализуемая при специфическом взаимодействиии катиона с Са2+-связывающими белками типа тропонина или калылодулнна. Общей особенностью кальций-связывающих белков, лежащей в основе механизма регуляции, является изменение конформации белка при связывании кальция, сопровождающееся изменением белок-белковых взаимодействий.
Важная роль Са2+ в ФС2 до последнего времени оставалась незамеченной. К моменту начала выполнения настоящей работы появились лишь первые указания на участие кальция в функционировании системы фотолиза воды в ФС2. Позднее было установлено, что ФС2 содержит два катиона кальция в расчете на один реакционный центр, один из которых расположен в КВК (Cal), а другой (Са2) локализован во внешнем антенном комплексе ФС2. Однако, роль этих катионов (структурная или регуляторная) и механизм их функционирования в ФС2 изучены в еще меньшей степени, чем марганца, поскольку лишь совсем недавно была окончательно установлена абсолютная необходимость кальция как кофактора в процессе окисления воды, экстракция которого полностью подавляет реакцию выделения кислорода.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было выяснение структурно-функциональной организации центров связывания катионов кальция и марганца, а также каталитической и регуляторной роли этих катионов в работе электрон-транспортной цепи ФС2.
В соответствии с этим в работе были поставлены следующие основные экспериментальные задачи:
- исследовать механизм участия кальция в процессе фотолиза воды в ФС2 и
природу молекулярных структур, обеспечивающих функционирование этого
катиона в КВК;
- изучить роль кальция в функционировании акцепторного участка
электрон-транспортной цепи ФС2 и исследовать природу молекулярных центров,
связывающих этот катион;
- исследовать лигандный состав координационной сферы марганцевого кластера, обеспечивающий его функционирование в КВК.
Научная новизна. Обнаружено, что блокаторы кальциевых каналов (БКК) являются эффективными ингибиторами кислород-выделяющего комплекса. Эффективность ингибирования находится в соответствии с их способностью инактивировать кальциевые каналы в клетках, что указывает на аналогию в организации Са2+-связывающих участков в КВК и кальциевом канале.. Высказано предположение, что в _Е"ВК с помощью кальция осуществляется регуляция процесса выведения протонов из гидрофобной зоны во внутритилакоидное пространство при разложениии воды.
Показано, что в тилакоидных мембранах (ТМ) на акцепторной стороне ФС2 имеется кальций-зависимое звено цепи переноса электронов. В аминокислотной последовательности полипептида D2 выявлен участок (Е225-А235), соответствующий EF-центру кальмодулина и расположенный с внешней стороны тилакоидной мембраны вблизи первичного хинонного акцептора Qa. Этот участок совместно с минорным белком СР29 внешнего антенного светособирающего комплекса, очевидно, формируют координационную сферу катиона кальция (Са2), после экстракции которого и наблюдается ингибирование электрон-транспортной цепи на акцепторной стороне ФС2.
Впервые обнаружено высокоэффективное связывание катионов железа Мп-
связывающим участком ФС2, которое по своим характеристикам аналогично
связыванию марганца с этим участком. В С-концевых участках полипептидов D1 и
D2 реакционного центра выявлены районы, аналогичные районам, связывающим
двухъядерный кластер - железа в железо-содержащих ферментах
(рибонуклеотидредуктаза, метанмонооксигеназа, десатураза). Сформулировано положение о том, что обнаруженные районы (аминокислотные остатки D319, Е329 и Н332 полипептида D1 и Е324, D334 и Н337 полипептида D2) формируют, координационную сферу марганцевого димера, входящего в состав четырехъядерного марганцевого кластера КВК. В стабилизации координационной сферы этого димера участвуют аминокислотные остатки E333(D1) и E338(D2), образующие водородные связи с Н337 (D2) и Н332 (D1) соответственно.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе экспериментальные результаты и теоретические обобщения расширяют представления о механизмах функционирования кальция в КВК, дают возможность использования в фотосинтетических исследованиях БКК и ЛА в
качестве новых классов ингибиторов донорного участка ФС2 и открывают
/
перспективы разработки экспресс-методов в скрининге биологической активности производных дигидропиридина, имеющих фармакологическое применение.
Обнаружение кальциевой .чувствительности переноса электронов на акцепторной стороне ФС2 и предложенная модель взаимодействия между реакционным центром и светособирающим комплексом открывают возможности более глубокой интерпретациии структурно-функциональной организации макромолекулярных комплексов ФС2 и, в том числе, механизмов регулирования рассеивания энергии.
На основе обнаруженного высокоэффективного связывания . -катионов двухвалентного железа с Мп-связывающим участком КВК разработана методика замещения Мп на катионы железа в КВК, позволяющая использовать метод мессбауеровской спектроскопии для изучения координационной сферы марганцевого кластера и взаимодействия этого кластера с другими кофакторами КВК. Сравнительный анализ аминокислотной последовательности белков D1 и D2 реакционного центра ФС2 и диферро-оксо ферментов выявил аминокислотные остатки, наиболее вероятно участвующие в связывании марганцевого димера, входящего в состав четырехъядерного марагнцевого кластера КВК, что открывает новое перспективное направление в исследованиях механизма фотолиза воды, в том числе и с использованием точечного мутагенеза.
Апробация работы. Результаты исследования докладывались на Всесоюзных и Международных конференциях и съездах: Международная конференция по применению Мессбауеровского эффекта (Индия, 1981); 1-й Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982); Всесоюзная конференция "Кинетика и механизмы электронного переноса в белковых системах и их моделях" (Вильнюс, 1985); Международный симпозиум "Электромагнитные поля и биомембраны" (Болгария,1989); : Международная конференция по применению Мессбауеровского эффекта (Венгрия ,1989); 3-й Конгресс Европейского общества по фотобиологии (Венгрия, 1989); Всесоюзная конференция "Преобразование световой энергии в фотосинтезирующих системах и их моделях" (Пущине, 1989); Международная конференция по применению Мессбауеровского эффекта (Китай,1991); IX Международный Конгресс по фотосинтезу (Япония, 1992); 11-я ежегодная региональная конференция по фотосинтезу (США, 1994); 12-й Немецко-Российский семинар по использованию Мессбауеровской спектроскопии (ФРГ, 1994); 2-й Международный симпозиум по биологической физике (ФРГ, 1995); Международная конференция "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996).
Отдельные разделы работы выполнены при финансовой поддержке Российского Фонда фундаментальных исследований, Совета Канады по естественный наукам и инженерным исследованиям (Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada), Немецкого научно-исследовательского общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft) и Фонда химической индустрии Германии (Germany, Fond der Chemischer Industrie).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 50 работ в центральных академических и международных изданиях.
Методические аспекты работы. В качестве объектов исследования были использованы тилакоидные мембраны и BBV-препараты ФС2 (Berthold et al., 1981), выделенные из листьев гороха или шпината.
Скорость транспорта электронов измеряли, регистрируя выделение кислорода (полярограф LP7E или прибор Hansatech с электродом Кларка ) или восстановление 2,6-дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ, є=21.8 мМ"1 см"' для ионной формы).
Экстракцию кальция из исследуемых объектов цитратным буфером с низким рН проводили по методу Оно и Иноуе (Ono, Inoue, 1988). Марганец из КВК экстрагировали 0.8М Трисом с рН 8,5 (Hsu et al., 1987). Для регистрации связывания марганце- или катионов железа с Мп-связывающим участком применяли метод Хсу с соавт. (Hsu et al.,1987). В качестве модификаторов карбоксильных групп аминокислот были использованы 1-этил-З-(диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДАК) (McCubbin and Kay, 1973) и дициклогексилкарбодиимид. Содержание железа в растворах определяли с помощью о-фенантролина (Umland et al., 1971). Стабильные при физиологических рН растворы трехвалентного железа получали по методу Чарлей с соавт. (Charley etal.,1963).
Инструментальные методы. Кинетику индукции флуоресценции в минутном диапазоне измеряли на установке Hansatech (Hansatech Instruments Limited, UK), в секундном диапазоне на флуориметре РАМ-101 (Walz, Effeltrich, FRG). Интенсивность миллисекундной замедленной флуоресценции (ЗФ) измеряли в стационарной фазе индукционной кривой, а долгоживущую ЗФ через 2 с после выключения света при помощи фосфоросколической установки (Васильев и др., 1988). Данные ЗФ обрабатывали с помощью программы GIM, позволяющей разложить кривую затухания на сумму экспонент (Provencher, 1976). Относительный выход постоянной и переменной флуоресценции хлорофилла
измеряли при помощи импульсного флуориметра (Лядский и др., 1987). Оптические характеристики препаратов измеряли при комнатной температуре и температуре жидкого азота на спектрофотометрах СФ-10, Hitachi-557 и спектрофлуориметре MPF-2A. Спектры ЭПР измеряли на радиоспектрометре РЭ-1307. Калориметрические исследования были выполнены с помощью дифференциального сканирующего микрокалориметра ДАСМ-1М. Мессбауероьские спектры регистрировали на спектрометре с равноускоренным перемещением источника излучения ^Со в Rh при неподвижном поглотителе.