Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы
1.1. Спектральные свойства мероцианина-540 8
1.1.1. Влияние полярности растворителя 8
1.1.2. Влияние рН растворителя 11
1.1.3. Влияние катионов 12
1.1.4. Влияние микроокружения 13
1.2. Типы фотохимических реакций фотосенсибилизаторов 14
1.3. Фотохимические реакции мероцианина-540 19
1.3.1 . Биологическая активность фотопродуктов мероцианина'540 26
1.4. Современные представления о механизмах развития реакций 31
замедленного типа (ГЗТ и КЧ)
Глава 2. Материалы и методы 41
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Спектральные и фотохимические свойства М1Д540 50
3.1.1. Зависимость спектров поглощения и возбуждения флуоресценции МЦ540 от растворителя 50
3.1.2. Фотолиз МЦ540 в водных и этанольных растворах 57
3.2. Действие МЦ540 и его фотоиродуктов на эритроциты и метгемоглобин
3.2.1. Гемолиз, индуцированный необлучепным и фотоокисленным 66 МЦ540
3.2.2. Превращения метгемоглобина, индуцированные 71 предоблученным МЦ540
3.3. Влияние продуктов фотоокисления МЦ540 на реакции гиперчувствительности замедленного типа у мышей
3.3.1 Модуляция фотопродуктами МЦ540 реакции 75
гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана
3.3.2. Супрессорное действие продуктов фотодеградации МЦ540 на реакцию контактной чувствительностиХКЧ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) и оксазолону у мышей
3.3.3. Выяснение иммунных механизмов супрессии реакции КЧ, обусловленной продуктами фотодеградации МЦ540 85
Ослабление функций эффекторов КЧ 85
Активация клеток с супрессорным потенциалом 89
3.4. Супрессорное действие фотоокисленного псоралена (ФОП) на реакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей
3.4.1. Изучение дозовых зависимостей ФОП на реакцию КЧ 96
3.4.2. Выявление специфичности супрессорного действия ФОП на 100 КЧ
Выводы 108
Список литературы
- Влияние микроокружения
- Биологическая активность фотопродуктов мероцианина'540
- Действие МЦ540 и его фотоиродуктов на эритроциты и метгемоглобин
- Супрессорное действие фотоокисленного псоралена (ФОП) на реакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей
Введение к работе
Мероцианин-540 (МЦ540) - фотосенсибилизатор - соединение, повышающее чувствительность биообъектов к свету. Это соединение успешно применяется в фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty T.J., 2002; Hopper С 2000].
ФДТ - один из современных методов лечения ряда онкологических и неонкологических заболеваний, основанный на воздействии света на ткани, содержащие фотосенсибилизатор (ФС) [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002; Collaud S., 2004; Beischer A.D. et al.. 2002; Kirdaite G. et al., 2002; Ibbotson S.H.. 2002]. Метод заключается в следующем: при однократном введении в организм человека ФС, его молекулы избирательно накапливаются в высокопролиферирующих тканях (например, опухолях) и повышают чувствительность этих тканей к световому излучению определенной длины полны (в области поглощения ФС). После введения ФС на ткани пациента, содержащие ФС, воздействуют светом, инициирующим фотобиологические процессы, которые приводят к разрушению опухоли, ее рассасыванию и замещению соединительной тканью [Wilson B.C., 2002].
Предполагается, что фотодеградация опухолевых тканей при ФДТ может происходить по двум механизмам [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002]:
прямое повреждение опухолевых клеток, приводящее к индукции апоптоза или некроза;
непрямое повреждение опухолевых клеток в результате разрушения сосудов опухоли (что приводит к ее некрозу), или активации иммунных механизмов.
Данные механизмы противоопухолевого действия ФДТ могут инициироваться в результате протекания фотохимических реакций ФС двух типов (тип I и II). В реакциях типа I происходит перенос электрона (или Н) между молекулами ФС в триплетном возбужденном состоянии и биосубстратом, в результате образуются радикалы ФС и/или субстрата. Свободные радикалы затем взаимодействуют с молекулярным кислородом, что приводит к необратимым повреждениям биосубстрата [Ochsner М., 1997; Foote C.S., 1991]. В реакциях типа
II происходит перенос энергии с триплетного ФС на молекулярный кислород с образованием электронно-возбужденного синглетного кислорода ( О?), который повреждает биологический субстрат [Ochsner М. 1997; Moan J. and Berg К., 1991].
В последние годы обсуждается другой, отличный от типов I и II, фотохимический механизм, существенный для ФДТ. Этот механизм заключается в том, что повреждение (модификацию) биосубстрата вызывают относительно стабильные фотопродукты ФС, а не !02 или свободные радикалы. Фотопродукты ФС образуются в результате автофотоокисления самих молекул ФС по следующей схеме:
ФС——>..?ФС' + 02 >фотопродуктыФС ,
где ФС и 3ФС* - молекулы фотосенсибилизатора в основном и возбужденном триплетном состояниях, соответственно.
Данные литературы о механизме реакций автофотоокисления МЦ540 в растворах противоречивы и требуют дополнительных исследований.
В литературе предполагается, что противоопухолевая активность ФДТ с использованием МЦ540 может быть следствием действия его фотопродуктов. Так, например, обнаружено, что продукты фотоокисления МЦ540, полученные путем облучения данного ФС, способны ингибировать пролиферацию, вызывать апоптоз и некроз различных типов опухолевых клеток в культурах in vitro. Показано также, что введение фотопродуктов МЦ540 мышам с привитыми опухолями, приводит к замедлению роста и деградации опухолей [Gulliya K..S. et al., 1990; Pervaiz S. et al., 1998; Pervaiz S., 2001]. Присутствуют данные о способности фотопродуктов инактивировать in vitro различные типы вирусов [Тгап С.С. et al., 1992]. До сих пор остается неясным, могут ли перечисленные биологические эффекты фотопродуктов МЦ540 быть следствием повреждения мембран клеток. В этой связи изучение мембранотоксических свойств фотопродуктов МЦ540 является актуальным.
С другой стороны известно, что одним из механизмов противоопухолевой активности ФДТ, например с такими красителями, как порфирины и хлорины, может быть влияние ФДТ на иммунную систему [Dougherty T.J., 2002; Wilson B.C., 2002]. Известно так же, что проведение ФДТ с упомянутыми красителями часто сопровождается угнетением Т-клеточного иммунитета [Simkin G.O. et al.
7 1997; Simkin G.O. et al., 2000, Musscr D.A. and OscroIT A..R., 2001 J. В литературе отсутствуют данные о том, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на Т-клеточный иммунный ответ in vivo. В этой связи изучение эффектов фотопродуктов на иммунную систему также является актуальным.
Цель настоящей работы:
Изучить фотофизические и фотохимические свойства МЦ540 и оценить биологическую активность его фотопродуктов.
Задачи исследования:
1. Изучить методами спектрофотомерии и епектрофлуориметрии влияние
растворителя на агрегацию и фотолиз МЦ540.
Исследовать мембранотоксические свойства фотопродуктов МЦ540 (пМЦ540) на модели гемолиза.
Изучить действие пМЦ540 на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в моделях реакций гиперчувствительности замедленного типа и контактной чувствительности у мышей и сравнить с эффектами фотоокисленного псоралена.
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Влияние микроокружения
В гетерогенных биологических системах МЦ540 будет распределяться в соответствии со своими коэффициентами распределения неодинаково между разными компаратментами. Его свойства будут определяться тем, в какую структуру он встроился в наибольшем количестве, и физико-химическими свойствами этой структуры, т.е. свойствами микроокружения, в котором оказалась большая часть МЦ540. Так, например, для МЦ540, помещенного в суспензию липосом из фосфатидилхолина, спектр поглощения характеризуется мономерным пиком около 568 нм и димерным -при 533 нм, сдвинутым вправо по сравнению с водными растворами, т.е. в суспензии липосом наблюдается сдвиг максимумов, который характерен и для неполярных растворителей (табл.1), например, хлороформа [Sikurova L. and Cunderlikova В., 1997]. Причем, чем выше концентрация липосом, тем интенсивнее длинноволновый максимум и ниже коротковолновый, т.е. наблюдается тенденция к уменьшению количества агрегированных димерных форм [Singh R.J. et al., 1991]. Добавление к данной суспензии отрицательно заряженной димиристоилфосфатидиловой кислоты, приводит к сдвигу спектра влево и снижению пика, соответствующего мономерам красителя. Таким образом, электростатическое отталкивание между отрицательными зарядами, присутствующими на молекулах МС540 и в липосомах. препятствует проникновению ФС в гидрофобную часть мембраны и уменьшает концентрацию мономеров красителя в липосомах [Sikurova L., and Cunderlikova В., 1997].
МС540 из-за присутствия отрицательного заряда локализуется в области полярных головок фосфолипидов в мембранах, однако, если заряд нейтрализовать, то ФС может проникать в неполярную часть мембраны (т.е. растворяться в ней).
Одна из важных характеристик поведения красителя в разных растворителях является их способность образовывать агрегаты, которые могут влиять как на фотофизические свойства красителей (флуоресценцию, внутреннюю конверсию), так и на их фотохимические превращения.
Прежде чем приступить к исследованию фотохимических реакций присущих МЦ540, рассмотрим общие представления о типах фотосенсибилизированных реакций. В литературе существуют несколько классификаций фотохимических реакций фотосенсибилизаторов. Наиболее распространенная классификация предложена Футом [Foote C.S.. 1991; Krasnovsky А.А. Jr., and Foote Ch.S., 1993; Grossweiner L. I. Статья в Интернете: www.photobiology.com/educational/len2/singox.html], основаная на классификации реакций по характеру первичного фотопроцесса.
Согласно К. Футу [Foote C.S., 1991; Krasnovsky А.А. Jr., and Foote Ch.S., 1993] (схема 1), все фотосенсибилизированные реакции можно разделить на два типа.
К типу 1 относят реакции, в которых фотосенсибилизатор (ФС) в триплетном возбужденном состоянии первоначально взаимодействует непосредственно с субстратом (S), а не с молекулярным кислородом. В данных реакциях между молекулой фотосенсибилизатора в триплетном возбужденном состоянии и субстратом в основном состоянии происходи! перенос электрона (или водорода). При этом в зависимости от реагирующей пары такой перенос может происходить как с субстрата на сенсибилизатор, так и с ФС на субстрат. В результате этого образуются свободные радикалы, и кислород подключается к этим реакциям на более поздних стадиях, приводящих к фотоокислению ФС.
В реакциях типа II первичным является взаимодействие фотосенсибилизатора в триплетном возбужденном состоянии с молекулярным кислородом и результатом такого взаимодействия и образуется возбужденный синглетный кислород. Затем синглетный кислород взаимодействует с субстратом, окисляя последний. Значительно реже может происходить отрыв электрона от возбужденного фотосенсибилизатора с образованием супероксид-аниоиа (схема 1). В последующих реакциях окисления субстрата участвуют уже супероксид-анион и образующиеся из него другие активные формы кислорода [Foote C.S., 1991; Krasnovsky А.А. Jr. and Foote Ch. S., 1993]. Выяснить, по какому механизму протекает процесс фотосенсибилизированного окисления субстрата, бывает довольно сложно. Соотношение между процессами типа 1 и II в реакциях фотосенсибилизированного окисления субстрата может зависеть от условий микроокружения [Potapenko A.Ya., 1991; Dall Acqua F. and Martelli P., 1991]. Например, гематопорфирин в водных растворах или в мицеллах сенсибилизирует фотоокисление триптофана путем прямой реакции (без Ог), если концентрация триптофана высока, тогда как при низкой концентрации реакция идет за счет участия х02 [Владимиров Ю.А. и Потапенко А.Я., 1989].
Связывание сенсибилизаторов с биологическим субстратом обычно способствует протеканию реакций с прямым участием триплетных возбужденных состояний сенсибилизатора. Например, метиленовый синий, связавшийся с эпидермисом кожи, перестает генерировать синглетный кислород [Joshi Р.С. and Pathak М.А., 1984]. Генерация 02 гематопорфирином при связывании с эпидермисом ослабляется более чем в два раза по сравнению с водным мицеллярным раствором и почти в 10 раз по сравнению с раствором в этаноле [Pathak М.А. and West J.D., 1982; Moreno G., 1986].
Биологическая активность фотопродуктов мероцианина'540
Как отмечалось в разделе "Обзор литературы", фотолиз МЦ540, его выцветание, может происходить как по механизму типа I, так и по механизму типа II фотохимических реакций. В литературе имеются данные, подтверждающие обе точки зрения. При использовании разных методов исследования, установлено, что синглетный кислород генерируется, в основном, мономерными . формами МЦ540 [Singh R. J. et al., 1991], a агрегированные формы вносят небольшой вклад в этот процесс. Такая же закономерность наблюдается для флуоресценции: флуоресцируют в основном мономеры МЦ540, а агрегаты дают значительно меньший вклад во флуоресценцию (рис. 5, 6) [Bcrnik D. et al., 1999].
По литературным данным [Singh R. J. et al., 1992] МЦ540 встроенный в липосомы фотолизирует в основном в ходе реакций типа II, на это указывает ускорение фотолиза в тяжелой воде (D20) и ингибирование реакции фотовыцветания в присутствии азида натрия. В работе других авторов [Gulliya K.S.et al., 1990а; Franck В. et al., 1992; Davila J. et al., 1991, Gulliya K.S. et al., 1990b] также указывается на ведущую роль фотореакций типа II, что и отражено на схеме 3 раздела " Обзор литературы". В этих опытах раствор МЦ540 облучали красным светом, который не поглощается мероцианином-540, но поглощается добавленным в систему другим красителем, например, алюминий фталоцианинтетрасульфат (AlPcS). В этих экспериментах деструкция МЦ540 также усиливалась в тяжелой воде (D20) и ингибировалась реакция фотовыцветания в присутствии азида натрия, что указывает на участие синглетного кислорода в фотолизе МЦ540 [Singh R.J. et al., 1992].
Данные наших экспериментов указывают на то, что в водно-этанольных смесях при уменьшении концентрации этанола увеличивается количество агрегатов МЦ540, что видно по спектрам поглощения (рис. 4): чем выше оптическая плотность агрегированной коротковолновой формы, тем выше была скорость фотолиза МЦ540. В водных растворах при стимуляции агрегации добавлением солей, скорость фотолиза возрастала еще больше. Таким образом, в наших опытах показано, что агрегация благоприятствует фотолизу МЦ540. По-видимому, основной вклад в реакцию автофотоокисления МЦ540 в наших условиях вносят реакции типа І. В агрегатах возбужденные триплетные молекулы красителя хуже генерируют синглетный кислород [Singh R. J. et al., 1992], но при этом более эффективно происходят реакции типа I, заключающиеся в переносе электрона между возбужденной и невозбужденной молекулами в результате чего происходит ускорение фотолиза.
Следовательно, можно заключить, что фотолиз ускоряется в условиях, благоприятствующих агрегации МЦ540. Таким образом, наши данные позволяют предположить, что при автофотоокислении МЦ540 в растворах ведущую роль играют фотореакции типа І. В дальнейшем при изучении биологического действия фотопродуктов МЦ540 облучение с целью ускорения фоголиза мы проводили в расгворах с малым содержанием этанола и в присутствии фосфагно-солевого буфера.
В данном разделе нами изучалось влияние МЦ540, а также продуктов его фотолиза на проницаемость мембран эритроцитов. Это связано с тем, что для других фотосенсибилизаторов, например для нсоралена, известно, что они способны модифицировать цитоплазматические мембраны, увеличивая их ионную проницаемость [Potapenko A.Ya. et al., 1991; Potapenko A.Ya. et al., 1993; Saparov S.M. et al., 1991]. Например, псорален в концентрации 10"4 М увеличивает скорость темнового гемолиза эритроцитов примерно на 40% [Potapenko A.Ya. et al., 1993; Potapenko A.Ya. 1991]. Если же провести предварительное фотоокисление нсоралена, и к эритроцитам добавлять фотопродукты псоралена (ФОП), то гемолиз многократно ускоряется, и протекает не за 3-5 суток, а за несколько часов (или даже минут) [Potapenko A.Ya., 1991; Potapenko A.Ya. et al., 1994; Potapenko A.Ya. et al., 1988]. Таким образом, ФОП обладает очень мощным гемолитическим эффектом. Следовательно, одним из механизмов действия фотопродуктов фотосенсибилизаторов может быть нарушение ионной проницаемости мембран, и некоторые биологические эффекты фотопродуктов могут протекать по такому механизму. Поэтому мы исследовали гемолитическую активность МЦ540 и его фотопродуктов.
Поскольку необлученный МЦ540 довольно токсичен для клеток [Gulliya K.S. et al., І994а], на первом этапе необходимо было изучить гемолитические эффекты необлученного МЦ540.
На рис. 15 представлена зависимость скорости гемолиза эритроцитов, индуцированного необлученным МЦ540, от его концентрации. Эта зависимость похожа на логарифмическую с пороговой концентрацией около 10 мкг/мл. Наличие пороговой концентрации может быть обусловлено мицеллообразованием красителя в растворах.
Действие МЦ540 и его фотоиродуктов на эритроциты и метгемоглобин
Известно, что один из механизмов противоопухолевой активности ФДТ (например, с такими красителями как порфирины и хлорины) может являться действие ФДТ на иммунную систему [Dougherty Т.J., 2002]. Известно так же, что проведение ФДТ с упомянутыми красителями часто сопровождается угнетением Т-клеточного иммунитета [Musser D.A. and Oseroff A.R., 2001; Gollnick S.O. et al., 2001; Simkin G.O. et al. 1997]. Предполагается, что в случае онкологических заболеваний терапевтический эффект ФДТ с МЦ540 может быть следствием действия его фотопродуктов [Pervais S. et al., 1998; Pervais S., 2001]. По литературным данным известно, что продукты фотодеградации МЦ540 способны in vivo замедлять рост привитых опухолей у мышей [Gulliya K.S., el al., 1990] и ингибировать пролиферацию опухолевых клеток в культурах in vitro [Gulliya K.S. et al., 1990, Pervais S., 2001].Однако, не изучено, могут ли фотопродукты МЦ540 влиять на иммунную систему.
В этой связи одной из задач настоящего исследования было оценить способность продуктов фотоокисления мероцианина 540 влиять на Т-клеточный иммунитет. В качестве моделей Т-клеточного иммунного ответа in vivo, в настоящей работе, была использована реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана (ЭБ) [Lagrange P.M. et al., 1974; Black С. A., 1999] и реакция контактной чувствительности (КЧ) к 2,4-динитрофторбензолу (ДНФБ) или оксазолону у мышей [Grabbe S. and Schwarz Т., 1998; Gorbachev A.V., and Fairchild R.L.,2001 (a, b)].
Доказано, что развитие реакций ГЗТ или КЧ опосредуется специфическими Т-лимфоцитами [Grabbe S. and Т. Schwarz Т. , 1998]. Данные реакции проявляются в виде локального воспаления (отека) в месте повторного нанесения антигена (ЭБ, ДНФБ или оксазолона), легко воспроизводятся на лабораторных животных, часто используются в качестве моделей для оценки влияния эффектов фотодинамического воздействия на Т клеточный иммунитет [Edelson R.L., 1991; Heald P.W. et al., 1995; Simkin G.O. etal., 1997; Simkin G.O.etal., 2000]. На первом этапе настоящей работы было изучено действие продуктов фотолиза МЦ540 на ГЗТ к ЭБ. Мышей (самцы весом 18-20 г, возраст 8-Ю ь недель) линии СВА (Н-2 ) сенсибилизировали путем внутривенной инъекции 0,2 мл суспензии ЭБ (5x105 кл/мл) в физиологическом растворе (схема 6).
Через 96 ч после сенсибилизации мышам подкожно в подушечку задней лапки вводили 40 мкл суспензии ЭБ в концентрации 10 кл/мл (тест-инъекция). В другую заднюю лапку в качестве контроля вводили 40 мкл физиологического раствора. Через 24 ч после тест-инъекции у мышей при помощи специального микрометра оценивали величину отека опытной и контрольной лапок. Разность в отеке опытной и контрольной лапок служила мерой реакции ГЗТ. В опытных группах мышам через 72 ч после сенсибилизации (ЭБ) вводили внутривенно по 0,5 мл раствора МЦ540 (17 мкМ в ФБР, содержащем 10% этанола), облученного различными дозами видимого света зеленого диапазона (к = 546 нм, I = 23,6 Вт/м2).
В группе положительного контроля (К+) сенсибилизированным ЭБ мышам вводили внутривенно 0,5 мл растворителя (ФБР, содержащем 10% этанола) вместо пМЦ540! В качестве отрицательного контроля служила группа интактных (несенсибилизированных ЭБ) мышей, которым ввели внутривенно по 0,5 мл ФБР с 10% этанола и затем животным сделали подкожно тест-инъекцию ЭБ.
Интенсивность реакции ГЗТ к процентах рассчитывали по формуле: ГЗТ(%) = [(Е - К ) /(К - К -) х 100%, где Е, К+ и К отек лапки у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля, соответственно.
На рисунке 20 представлена зависимость изменения интенсивности реакции ГЗТ от дозы предоблучения раствора МЦ540. Видно, что введение мышам необлученного раствора МЦ540 (время облучения 0 ч) не приводило к изменению уровня реакции ГЗТ по сравнению с положительным контролем (К+). Предоблучение в течение 1 часа раствора МЦ540 приводило к увеличению на 49% интенсивности реакции ГЗТ у мышей (р 0,0()1 по сравнению с уровнем К+). Дальнейшее предоблучение МЦ540 приводило к монотонному снижению интенсивности реакции ГЗТ, и в диапазоне доз от трех до девяти часов облучения фотолизированный МЦ540 обладал супрессорным действием на ГЗТ. Фотолизированный в течение 9 часов МІД540 достоверно ингибировал ГЗТ на 65% (р 0,001 по отношению к К+).
Супрессорное действие фотоокисленного псоралена (ФОП) на реакцию контактной чувствительности (КЧ) у мышей
Таким образом, после введения пМЦ540 сенсибилизированным мышам-донорам в популяции спленоцитов появлялись клетки, угнетающие развитие КЧ при их адоптивном переносе сенсибилизированным мышам-реципиентам, т.е. предоблученный МЦ540 in vivo вызывал появление клеток, обладающих супрессорной активностью
Результаты, полученные в настоящем разделе исследования, позволяют сделать следующее заключение: во-первых, супрессия реакции КЧ, вызванная действием пМЦ540 может быть адоптивно перенесена другим животным; во-вторых, предоблученный МЦ540 способен in vivo активировать клетки с супрессорным потенциалом.
В литературе известно, что, например, для ФДТ с фотофрином подавляет КЧ путем активации С04+-лимфоцитов обладающих супрессорным потенциалом [Simkin G.O. et al., 1997; Musser D.A. and Oseroff A.R., 2001]. Данные лимфоциты продуцируют супрессорные цитокины (ИЛ-4, ИЛ-10), препятствующие развитию КЧ. При этом супрессия КЧ, индуцированная ФДТ с фотофрином - специфична [Musser D.A. and OserolT A.R., 2001]. Напротив, супрессия КЧ обусловленная действием ФДТ с гематопорфирином неспецифична, и клетками-супрессорами КЧ являются макрофаги [Lynch D. Н. et al., 1989]. Макрофаги, активированные ФДТ с гематопорфирином, вырабатывают простагландин Е-2, который в свою очередь, усиливает выработку ИЛ-10 кератиноцитами и Т-клетками, что приводит к супрессии КЧ [Lynch D. Н. et al., 1989].
Можно предположить, что МЦ540, как и фотофрин, мог активировать регуляторные супрессорные клетки С04+-лимфоциты, либо активировать макрофаги. Однако полученные нами результаты, не позволяют сделать вывод ни о типе (фенотипе) клеток с супрессорным потенциалом, активированных под действием пМЦ540, ни о специфичности реакции КЧ (рис. .26 А). В этой связи в следующей серии экспериментов мы оценивали специфичность супрессорного действия пМЦ540 на КЧ. Для этого были проведены эксперименты по адоптивному переносу супрессии реакции КЧ с использованием двух разных гаптенов: ДНФБ и оксазолона (схема 9 Б).
Мышей-доноров линии СВА сенсибилизировали путем накожной аппликации 50 мкл 0,3% раствора ДНФБ в ацетоне. Затем вводили по 0,5 мл МЦ540 без и после его облучения. Введение фотосенсибилизаторов проводили через 120 чпосле сенсибилизации мышей-доноров ДНФБ, и через 24 ч после введения фотосенсибилизатора выделяли селезенки. Сингеиным мышам-реципиентам вводили 108 силеноцитов. Мыши-реципиенты при этом были предварительно за 144 ч сенсибилизированы 2% раствором оксазолона в ацетоне. Через 1 ч после переноса спленоцитов мышей-реципиентов тестировали путем накожной аппликации на ухо 5 мкл 0,4% оксазолона. Через последующие 24 часа регистрировали интенсивность реакции КЧ мышей-реципиентов.
Были поставлены следующие иммунологические контроли (Схема 9 Б, рис. 26 Б): K2r: положительный контроль с переносом спленоцитов. Сенсибилизированным ДНФБ мышам-донорам вводили внутривенно 0,5 мл ФБР, содержащего 0,5% этанола. Через 24 часа выделяли селезенки. К)8 спленоцитов мышей-доноров переносили внутривенно сенсибилизированным оксазолоном мышам-реципиентам. Через 1 час после переноса мышам-реципиентам повторно наносили на ухо 0,4% оксазолоном. К2: отрицательный контроль на оксазолон в переносе. Мыши-доноры были сенсибилизированы ДНФБ и вместо пМЦ540 получили внутривенно 0,5% ФБР с 0,5% этанола. Через 24 ч были выделены селезенки этих животных и 108 спленоцитов были перенесены внутривенно интактным мышам-реципиентам. Через 1 ч после переноса спленоцитов мышам-реципиентам была проведена аппликация па ухо 5 мкл 0,4% оксазолона. ICj: отрицательный контроль без переноса спленоцитов. Интактных мышей тестировали, нанося на поверхность ушной раковины 5 мкл 0,4% раствора оксазолона.
Результаты данных экспериментов представлены на рисунке 26 Б. Видно, что перенос спленоцитов мышей-доноров, сенсибилизированных ДНФБ к интактным мышам-реципиентам, с последующей аппликацией реципиентам оксазолона, не приводил к развитию реакции КЧ (К"2). Видно также, что уровень отрицательного контроля в переносе (К{) не отличался от уровня отрицательного контроля на оксазолон без переноса на оксазолон. При этом у мышей-реципиентов, сенсибилизированных оксазолоном, повторная аппликация оксазолона приводила к развитию реакции КЧ (К2+). Эти данные свидетельствуют о том, что гаптены ДНФБ и оксазолон не являются перекрестными, т.е. эффекторы КЧ, сформировавшиеся после сенсибилизации ДНФБ, не отвечали на аппликацию оксазолона.
На рис. 26 Б видно также, что перенос спленоцитов от ДНФБ сенсибилизированных мышей-доноров, получивших инъекцию необлученного МЦ540, не повлиял на уровень реакции КЧ у сенсибилизированных оксазолоном мышей-реципиентов. Напротив, перенос спленоцитов мышей-доноров, получивших инъекцию облученного МЦ540 (пМЦ540), привел к угнетению на 75% ± 7% реакции КЧ мышей-реципиентов на оксазолон ( р 0,001 по сравнению с К+2).
Таким образом, предоблученный МЦ540 инициировал в селезенках сенсибилизированных ДНФБ мышей-доноров появление клеток, которые подавляли КЧ на чужеродный гаптен - оксазолон. Эти данные позволяют заключить, что супрессорное действие фотопродуктов МЦ540 является неспецифическим. Облученный МЦ540 in vivo активирует клетки с неспецифическим супрессорным потенциалом.
