Фотогенерация электрических потенциалов и транспорт ионов в мембранах хлоропластов и клетках растений Булычев, Александр Александрович

Введение к работе

Актуальность проблемы. Хлоропласта зеленых растений осуществляют уникальный процесс фотосинтеза, продуцируя кислород и органические вещества. Фотобиологическая функция хлоропластов, их жизнедеятельность и взаимоотношения с клеткой тесно связаны с мембранными электрохимическими процессами, которые развиваются на нескольких структурных уровнях: в тилакоидах, оболочке хлоропласта и плазматических мембранах клетки.

В тилакоидах происходит первичное разделение зарядов с образованием электрохимического градиента протонов. При этом возникают ионные потоки и меняется ионный состав, что важно для синтеза АТР, регуляции фотосинтеза и связано со структурными перестройками мембранной системы. Оболочка, состоящая из двух мембранных слоев, контролирует обмен с цитозолем (Douce, Joyard, 1990), а также импорт белков, которые синтезируются в виде предшественников в цитоплазме и попадают внутрь по гипотетическим транслокационным порам при участии АТР. Потоки ионов и метаболитов через оболочку хлоропласта лежат в основе ответных электрофизиологических реакций листа и целого растения на смену светового режима. Включение регуляторних механизмов на уровне клетки и плазмалеммы вызывает ориентационные движения хлоропластов, активацию электрогенного Н⁺ насоса я гиперполяризацию плазмалеммы, что стимулирует накопление К⁺ в цитоплазме, набухание замыкающих клеток и открывание устьиц.

В настоящее время наиболее очевидна роль мембранных процессов, происходящих в тилакоидных мембранах (ТМ). Энергия света используется на разделение зарядов или теряется в виде тепла и флуоресценции (Кукушкин, Тихонов, 1988). Благодаря векторной организации ЭТЦ, фотоперенос электрона создает в люмене положительный потенциал. Электрохимический градиент Ди_н+- с его электрической (Д<|>) и химической (ДрН) компонентами играет центральную роль в биоэнергетике, так как служит формой запасания энергии, движущей силой для синтеза АТР (Скулачев, 1989) и непосредственно регулирует активность мембранной Н⁺-АТРазы и ЭТЦ (Graber et al., 1984). Формирование Ац_н+ сказывается на плотности поверхностных зарядов ТМ (Barber, 1980), активности реакционных центров (РЦ) фотосистем I и II (Weis, Berry, 1987; Schreiber, Neubauer, 1990), выходе быстрой и замедленной флуоресценции хлорофилла (Vos, 1992).

Фотогенерация электрического потенциала и ионные потоки являются неотъемлемым проявлением фотосинтетической активности, однако электрические процессы изучены недостаточно вследствие методических

трудностей (в частности, малых размеров хлоропластов) и ограничений, присущих косвенным методам их изучения.

Важные успехи достигнуты при встраивании мембранных фрагментов (в основном бактериального происхождения) в модельные мембранные системы (Драчев, 1985), но этот метод почти не использовался для исследования электрогенных систем хлоропластов. Метод, основанный на электрохромгоме нативных пигментов (Witt, 1979; Junge, Jackson, 1982; Vredenberg, 1981), дает обширную информацию, однако он применим лишь в сочетании с короткими вспышками. При переходе к секундному диапазону электрохромный сдвиг АА.515 перекрывается с сигналами другой природы и теряется в изменениях светорассеяния. Соответственно, невозможно предсказать как меняется мембранный потенциал (МП) в индукционный период фотосинтеза, каков стационарный уровень МП, как зависят эти характеристики от внешних условий и состояния объекта.

Эти вопросы требуют выяснения, поскольку фотогенерация МП отражает и количество активных РЦ и частоту разделения зарядов в электрогенных комплексах. Это важно и потому, что МП связан с проницаемостью мембраны и наличием в мембране электрического поля, которое может влиять на перенос заряда в РЦ и на выход замедленной и быстрой флуоресценции. Мембранный потенциал может оказывать прямое действие на активность Н⁺-АТРазы и опосредованно влиять на фотосинтетические процессы, вызывая перераспределение ионов между тилакоидами и стромой и цитоплазмой. В связи с этим необходимы прямые методы изучения электрических процессов и мембранных свойств хлоропластов (на уровне тилакоидов и оболочки) и сопряженных транспортных и электрических процессов в интактной клетке.

Уже в начале этой работы был разработан прямой метод регистрации электрического потенциала ТМ. Преимущества такого подхода связаны с возможностью проводить измерения МП с миллисекундным разрешением как на изолированных пластидах, так и на хлоропластах in situ, измерять в одном опыте МП тилакоидов и плазмалеммы. По временному разрешению прямая регистрация намного превосходит метод, основанный на перераспределении красителей. С другой стороны, метод позволяет применять световые стимулы любой длительности, чем выгодно отличается от сигналов ДА515.

Модификации микроэлектродного метода открыли дополнительные возможности для исследования электрогенеза и транспорта ионов в клетках и хлоропластах. Применение рН-микроэлектродов позволяет измерять профили распределения рН в примембранных слоях, а также фотоиндуцированные потоки Н⁺ на уровне тилакоидов, оболочки пластид и целых клеток. В варианте пэтч-кламп микроэлектродный метод позволяет

смещать потенциал ТМ, что в сочетании с микрофлуориметрией открывает новый подход к изучению функциональной роли МП хлоропластов.

К началу данной работы почти все эти направления еще не были представлены. Оставались спорными вопросы о кинетике изменений МП в индукционный период и о стационарном уровне МП на свету. Не было ясности в вопросах о природе ионов, транспортируемых между тилакоидами и стромой под действием МП, о роли фотосистем I и II (ФС I и И) в генерации МП. Оставалась нераскрытой роль заряженных редокс медиаторов в электрогенезе и генерации электрохимических градиентов на уровне ТМ. Эти и другие вопросы рассмотрены в данной работе.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы заключалась в изучении механизмов фотогенерации электрического потенциала на ТМ в связи с энергетическим сопряжением, трансмембранным переносом электронов и протонов, а также в исследовании ионного обмена в системе хлоропласт-цитоплазма-среда для выяснения процессов, приводящих к трансформации фотостимула в ответную физиологическую реакцию растительной клетки. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать прямые методы измерения фотогенерации потенциала в ТМ хлоропластов; исследовать динамику изменений МП при импульсном и непрерывном освещении в разнообразных условиях, в т.ч., при раздельном функционировании ФС I и ФС II, в условиях энергетического сопряжения и разобщения, модификации индукционных процессов путем темповой адаптации и предварительного освещения.

2. По влиянию ионного состава среды и ионофоров на фотогенерацию МП и транспорт природных и редокс-активных ионов охарактеризовать проводящие системы ТМ; изучить фото- и потенциал-зависимые ионные токи в мембранах тилакоидов и оболочки хлоропласта.

3. Исследовать связь МП с другими фотопроцессами, выявляемыми по флуоресценции хлорофилла а; по эффекту приложенного потенциала на флуоресценцию оценить возможное влияние фотогенерации МП на процессы разделения, стабилизации и рекомбинации зарядов в ФС II.

4. Исследовать светозависимые изменения МП и транспорт протонов в системах с разным уровнем организации (изолированные тилакоиды, целые хяоропласты, капля протоплазмы с интактными пластидами, клетки водорослей, мхов и высших растений) для выявления электрических и ионных сигналов, осуществляющих связь фотопроцессов в хлоропластах с ответной электрофизиологической реакцией клеток и целого листа зеленых растений.

Научная новизна. Впервые разработаны прямые методы исследования фотогенерации электрического потенциала на фотосинтетических мембранах целых хлоропластов. Выявлена зависимость индукционных кривых МП от скорости электронного транспорта и ионной проводимости ТМ. Сформулированы представления о диффузионной и электрогенной составляющих МП, и оценены проводимости ТМ в разных условиях. Показано наличие в индукционной кривой МП задержанного по времени электрогенного компонента, обусловленного фотоактивацией транспорта электронов в области ФС I. С помощью рН-микродатчика прослежена динамика установления Дц_н+ в одиночном хлоропласте. Впервые показано усиление и ослабление флуоресценции хлорофилла а при сдвигах МП тилакоидов в положительную и отрицательную стороны, соответственно. Показано, что чувствительность флуоресценции хлорофилла к сдвигам МП изменяется при переходе акцептора ФС II (Q) в восстановленное состояние. На клетках мхов, содержащих одиночные крупные хлоропласта, выявлены запускаемые светом потенциалы действия, и изучена их природа. Методом пэтч-кламп впервые измерены ионные токи ТМ, вызываемые короткими вспышками и длительным освещением. Изучены электрические свойства мембран оболочки хлоропластов, и показано влияние МП и физиологически-активных факторов на их проводимость.

Научно-практическая ценность работы. Полученные результаты указывают на важную роль МП при фотосинтезе. Они послужили одним из доказательств хемиосмотической гипотезы энергетического сопряжения и отражены в обзорных и справочных изданиях по фотосинтезу и физиологии растений. Разработанные методы анализа МП и ионных токов ТМ, наряду с микрометодами регистрации трансмембранных потоков Н⁺ и профиля рН у поверхности клеток и органелл, расширили круг подходов к изучению фотоэлектрических и ионных процессов в мембранных системах и внедрены в ряде отечественных и зарубежных лабораторий. Данные о кинетике индукции МП легли в основу моделирования электрохимических процессов при фотосинтезе. Разработаны мембранные электроды, чувствительные к заряженным редокс-медиаторам, которые выявили трансмембранный перенос редокс-активных катионов при циклическим транспорте электронов, образование градиентов концеїпрации экзогенного иона и взаимодействие нативных и искусственных транспортных систем. Данные о влиянии МП тилакоидов на флуоресценцию хлорофилла послужили основой для теоретической модели процессов разделения-рекомбинации зарядов во внешнем электрическом поле и подтверждены в ряде лабораторий (Dau et al.,

1991; Dau, Sauer, 1991). Результаты используются при обучении студентов, отражены в учебных пособиях и практикумах.

Апробация работы. Результаты работы были доложены или представлены на Всесоюзных конференциях по биофизике мембран (Паланга, 1971-1976), Международных биофизических конгрессах (1972, 1975, 1978), Всесоюзном симпозиуме "Структурная лабильность мембран" (Минск, 1974), XII Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), Всесоюзных конференциях по фотоэнергетике растений (1978, 1980), Всесоюзном симпозиуме по ионному транспорту в растениях (Черкассы, 1977), Международном симпозиуме по мембранным рецепторам (Смоленице, ЧССР, 1981), на Первом всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), рабочем совещаніш по программе "Ионный канал" (Каунас, 1983), Международном совещании по мембранному транспорту в растениях (Прага, 1983), конференции по биологии клетки (Тбилиси, 1985), межуниверситетском семинаре преподавателей кафедр биофизики (Воронеж, 1987), Втором всесоюзном съезде общества физиологов растений (Минск, 1990), научных семинарах кафедры биофизики биологического факультета МГУ и отдела биоэнергетики межфакультетской лаборатории биоорганической химии им. А.Н. Белозерского (1974-1992), на семинаре отдела биоэлектрохимии Института электрохимии РАН (1993), рабочем совещании по липидам и мембранам (Лунтерен, Голландия, 1994), научных семинарах в университете г. Вагенингеи и в центре исследования биомембран и этимологии липидов университета г. Утрехт (1994), на международных курсах по биоэнергетике и транспорту ионов в мембранах растительной клетки (Турку, 1994), курсах по биофизике растений (Вагенннген, 1994), X международном конгрессе по фотосинтезу (Монпелье, 1995), на международном совещании по мембранной биоэнергетике (Москва, 1995), международной конференции по биоэнергетике фотосинтеза (Пущино, 1996).

Результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете.

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 90 статьях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, описания объектов и методов исследования, пяти глав с изложением полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы из 261 наименования. Работа изложена на 185 страницах, иллюстрирована 4 таблицами и 84 рисунками.