Фоточувствительность изоформ лактатдегидрогеназы в присутствии некоторых химических агентов Лысенко, Юлия Александровна

Введение к работе

Актуальность проблемы. Проблема выявления механизмов фотохимических и фо-зических процессов, происходящих в полимерных макромолекулах под действием ческого излучения, имеет междисциплинарный характер. Воздействие квантов све-Ф- и видимого диапазона шкалы электромагнитных колебаний на биосистемы по* ) положительного эффекта (образование витамина Д, увеличение неспецифической ^ентности, лечебное действие при некоторых кожных заболеваниях и т. д.) может одить и к негативным последствиям (ожоги кожи и глаз, старение кожи, каниероге-иммуносупрессия и др.). Вид и степень фотоповреждения определяются спектром гвня и дозой облучения. Появление фотобиологическігх эффектов в области длин

более 280 нм. пропускаемой озоновым слоем атмосферы, вызвано, в основном, реями с участием фотосенсибилизаторов. В реальных биологических системах в каче-последних могут выступать коферменты, витамины и другие внутриклеточные ме-1иты. Известно, что фотосенсибнлизирующие свойства могут проявлять некоторые зственные препараты, пищевые красители. Для ряда прикладных направлений фомин и медицины (фотодинамическая терапия онкологических заболеваний (J. Моап. uisteansen. 1980; S.G. Brown, 1983)) необходимо иметь возможно более фоточувст-пьные системы: с целью стабилизации и защиты полимеров приходится решать ивоположную задачу — торможения фотохимических реакций. Поэтому актуаль-является вопрос о регулировании скоростей этих процессов. Особенности фотомі-полимеров связаны со сложностью макромолекул, зависимостью их свойств и ре-онной способности от конформаиии. а также с многостадийностью протекания фортификационных процессов и участием в них промежуточных соединений.

Важную роль в фотоокислении биологических молекул играют активные формы орода: синглетный молекулярный кислород — 0₂; супероксидный анион радикал it; гидропероксидный радикал — НО,; радикал гидроксила — ОН, а также перок-їодорода — НїОі. Фотоселсибилизированные реакшш с участием ^[0₂ широко рас-транены и названы фотореакциями типа II. Окислительная активность 'От приблизно в 100 раз выше таковой "0₂. Потенциальными источниками генерации О; в огических и модельных системах могут являться различные световые и темновые ессы: генерация '0₂ синглетными и триплетными состояниями фотосенсибилизато-дисмутация ОІ, продуцирование 'Ог системой миелопероксидаза-НіОі-гипохло-нри активации фагоцитов и т. д. В процессе клеточного метаболизма образуются е другие активные формы кислорода, в частности, высокореакционноспособный кал гидроксила, обладающий сильнейшим цитотоксическим действием.

В норме организм имеет мощную антиоксидантную и фотопротекторную системы [ты. Но при различных патологиях и действии экстремальных факторов необходимо

предусматривать дополнительные меры, повышающие устойчивость к фотоокисле или избирательно уменьшающие таковую (при фотодинамической терапии).

Основная задача состоит в том, чтобы оценить реальный вклад реакции кал активной частицы в сложный процесс фотодеструкции, определить константы скор образования (выхода) различных интермедиатов для целенаправленного управлі происходящими в изучаемой системе изменениями. Следовательно, в этом плане буются количественные исследования фотоокисления биологических соединений, ходя из вышеизложенного, представляется актуальным проведение эксперименте модельных объектах с использованием биомакромолекул и экзогенных фотопротеь ных агентов с известным характером действия, в частности, способных селективно минировать определенные формы "'активированного" кислорода, для оценки возмо: го участия последних в фотоиндуцированных процессах, развивающихся в биосисте

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы явилось выявление особенно прямых и сенсибилизированных фотохимических модификаций изоферментов пакт; гндрогеназы (ЛДГ) при воздействии оптического излучения различного спектраль состава в условиях модуляции их фоточувствительности акцепторами активных (] кислорода и внутриклеточными метаболитами.

Задачи работы предусматривали: 1) исследование каталитической активное спектрально-люминесцентных характеристик лактагдепщрогеназы при УФ-облучении в присутствии дезактиваторов синглетного кислорода (Д-каротина. тидина и азида натрия); акцепторов ОН-радикалов (D-маннита и третичного бутан информационного кофактора— NADH; 2) изучение характера изменения кинет ских параметров связывания лактатдегидрогеназой субстрата при УФ-облучении в сутствии азида натрия и D-маннита; 3) сравнительный анализ кинетических коне УФ-инактивацпн сердечной и мышечной изоформ лактатдегидрогеназы в присутс некоторых потенциальных фотопротекторов; 4) измерение инфракрасных спектрої глощения азида натрия в присутствии ЛДГ с целью уточнения механизма протектор действия модификатора; 5) изучение сенсибилизированного метиленовым голубьь\ тоокисления изоформ ЛДГ при широком варьировании концентраций белка и экз< ного соединения; 6) определение степени УФ-инактивации смеси изоформ ткане экстракта сердца свиньи.

Научная новизна. Впервые проведены систематические исследования, посвя ные сравнительнму анализу структурно-функциональных изменений отдельных форм ЛДГ, УФ-облученньгх в присутствии широкого спектра соединений, являюи как внутриклеточными метаболитами, так и экзогенными веществами. Выявлена синглетного молекулярного кислорода в процессе фотоинактивации мышечной изс мы ЛДГ при ее УФ-облучении в дозе 2,27 кДж/м.². Показана возможность окис;

Г (hU) синглетным кислородом при его внешней генерации. Вычислены константы рост» фотоинактивации и время полупревращения ЛДГ (Н₄) и (МД Изучено сенск-іизированное метиленовим голубым фогоокисление нзоформ ЛДГ, определен вклад годшгамического действия красителя в процессах фотохимического превращения мо-ул лактатдегидрогеназы. Исследована УФ-чувствительность смеси изоферментов невого экстракта сердца свиньи, что может оказаться полезным для дальнейшей разотки критериев фотохимического поведения фермента в клетке.

Практическая значимость. Полученные результаты расширяют теоретические дставления, касающиеся механизмов фотохимических превращений сложных белков рисутствии экзогенных соединений; участия активных интермедиатов (например, 'СЬ !Н-радикалов) в фотомодификационных процессах белковых систем. Результаты экс-іиментов будут способствовать разработке теоретических основ протекторного и сен-іилизирующего действия различных модифицирующих агентов, фотодинамической алии онкологических заболеваний; выяснению условий избирательного повреждения і защиты биомакромолекул в различных режимах их облучения. Полученные данные ут быть использованы при чтении студентам биологических факультетов универсн-ов обших и специальных курсов: "Биофизика", "Физико-химическая биология", эгобиология". "Химическая энзимология". "Экологическая биофизика".

Апробация работы. Материалы работы рассмотрены и доложены на Всероссий-й конференции "Физико-химические основы и практическое применение ионооб-іньіх процессов" (Воронеж. 1996); I и II Всероссийских конференциях фотобиологов /щино, 1996, 1998): Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" юдно. 1996); II Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и юпективы их практического использования" (Пушино, 1997); Международной школе роблемы теоретической биофизики" (Москва, 1998); Международной конференции олекулярные механизмы функционирования сложных белков и их комплексов" (Во-ієж, 1998); V Международной конференции "'Биоантиоксиданг' (Москва. 1998>; альской конференции молодых ученых "Физика в биологии и медицине" (Екатерин-)г, 1999); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверсистета (1996; 1998;

>9).

На защиту выносятся следующие положения.

1. 3 -Каротин, D-маннит, азид натрия, гистндин, третичный бутанол, серотонин и iDH являются модуляторами фоточувствительности лактатдегидрогеназы при ее >-облучении (240-^-390 нм) в дозе 2,27 кДж/м². Результирующий эффект (сенсибилиза-i или протекторное влияние) определяется концентрацией модификатора.

2. Синглетный кислород относится к числу промежуточных продуктов процесса Мшактивации ЛДГ.

3. Процессы фотоинактивашіи мышечной и сердечной изоформ лактагдегидрс назы в свободном состоянии и в присутствии D-макнига и серотонина относятся к ка гории мономолекулярных реакций первого порядка; it смеси с азидом натрия поря, реакции сменяется на нулевой.

4. Метиленовый голубой (МГ) является сенсибилизатором инактивации ЛДГ и форм Mi и ЬЦ как при его возбузкдении в видимом, так и в УФ-спектральном диапа нах; повреждающий эффект определяется количестве, тым соотношением молекул Л и МГ. Роль динамического действия МГ (участие ^!Ог) и его сенсибилизирующий эфф существенно возрастают при иммобилизации красителя на силикагеле.

5. Схемы возможных реакций, развивающихся і системах ЛДГ-NADH и ЛДГ-.N при действии УФ- и видимого света.

Структура диссертации. Диссертационная работа включает/%3> страниц маши писного текста, 7 табл.. 29 рис. Состоит из Введения... 8 глав. Заключения и Вывод Список литературы содержит ^ристочников, из них /<%f— отечественных и v г*— рубежных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и 8 тезисов,