Физико-химический анализ высокодисперсных белоксодержащих систем на основе микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии Молодкина, Людмила Михайловна

Введение к работе

Актуальность темы

Диссертационная работа посвящена разработке и реализации подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащнх систем (ВВССБС), необходимому для понимания физико-химической природы и механизмов процессов структурных изменений, происходящих на разных уровнях их организации.

Такие системы широко распространены в природе и в техносфере. Их отличает характерный размер взвешенных частиц, не превышающий 200 им, полидисперсность, многокомпонентность, присутствие белковых соединений в растворенном состоянии,, в виде ассоциатов и входящих в состав биоминеральных частиц. К ВВССБС готносятся системы, чрезвычайно важные для биотехнологии, экологии, < медицины - Зто, например, сырье и продукты вакцинного производства, питьевая вода, биологические жидкости человека и животных. Под влиянием внешних воздействий в таких системах происходят конформационные изменения белковых молекул, взаимодействия между различными компонентами. Эти і процессы ведут к структурным изменениям на молекулярном;: надмолекулярном, межчастичном уровне. Понимание их природы и механизмов важно не только в познавательном, причинном и прогностическом плане. Оно необходимо и в: практической работе с высокодисперсными белоксодержащими системами ^: при производстве биологически активных препаратов, получении чистой питьевой-воды,;в медицинской диагностике и т.п. Все это определяет актуальность тематики исследования.

Обычно при практическом изучении ВВССБС проводят компонентный анализ с
последующей постановкой ' модельных экспериментов над индивидуальными
компонентами при варьировании отдельных факторов,- либо с организацией
многофакторных исследований. В представленной работе предлагается иной подход. Он
основан на экспериментальном определении функциональных характеристик состояния и
поведения компонентов, несущих обобщенную информацию о системе на выбранном
уровне ее структурной организации, на установлении, физико-химической природы-
определяющих их причин. Возможность выбора таких «носителей информации» связана с
тем, что электроповерхностные свойства взвешенных частиц отображают состав и
свойства поверхностно активных (в том числе белковых) молекулярно растворенных
соединений, а также веществ, диссоциированных на ионы; в свою очередь,
электроповерхностные свойства определяют силы взаимодействия между частицами, т.е.
возможность и характер их агрегации.

2 '

Цель и задачи работы

Цель настоящей работы состояла в разработке, аппаратурно-методическом оформлении и реализации подхода к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем экологического и медицинского назначения.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

1. сформулировать принципы и разработать концепцию подхода к изучению ВВССБС;

2. создать аппаратурно-методический комплекс для регистрации высокодисперсных белоксодержащих частиц с возможностью определения их концентрации, размера, электрокинетических свойств, распределения частиц по этим показателям,

3. выбрать методы и материалы для фракционирования и концентрирования компонентов ВВССБС, не повреждающие их структуру, и разработать на их основе методики целевой трансформации систем для их перевода на определенный уровень структурной организации;

4. обосновать выбор информативного набора физико-химических характеристик ВВССБС, которые следует определять для разных уровней их структурной организации;

5. на примере ВВССБС, значимых для медицинской биотехнологии и экологии, продемонстрировать научно-практические возможности разработанного подхода и созданного аппаратурно-методического комплекса.

11а защиту выносятся основные положения и результаты:

6. обоснование и содержание комплексного подхода к изучению ВВССБС экологического и медицинского назначения, включающего, а) трансформацию (структурное упрощение) исследуемой системы, проводимую для получения информативного уровня ее структурной организации; б) формирование на новом уровне структурной организации одной или нескольких систем сравнения, различающихся по заданному признаку; в) зксперимеїггальное определение функциональных характеристик взвешенных частиц, отражающих их электрокинетические свойства и поведение при агрегации; г) анализ суммарного содержания полученных характеристик с учетом уровня организации трансформированной системы;

7. аппаратурно-методическое обеспечение разработанного подхода к изучению ВВССБС в виде созданных высокочувствительных установок на основе методов микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии;

8. информационное содержание определяемых функциональных характеристик для разных уровней структурной организации ВВССБС (на примере конкретных дисперсий),

4. практическое приложение аппаратурно-методических разработок и результатов исследования ВВССБС. Шумная новизна работы

1. Впервые предложен и осуществлен комплексный подход к изучению водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем. Он включает:

целевую трансформацию исследуемой системы, для получения информативных уровней ее структурной организации;

формирование на новом уровне структурной организации одной или нескольких систем сравнения, различающихся по заданному признаку;

определение методами микроэлектрофореза и поточной ультрамикроскопии . фунщионачьных характеристик взвешенных частиц, отражающих их электрокинетические свойства и поведение при агрегации,

анализ суммарного содержания определенных физико-химических характеристик в соответствии с уровнем организации трансформированной системы, выявляющий молекулярные и надмолекулярные механизмы процессов, происходящих с участием белковых (или производных от них) соединений ; ' '

2Впёрвые экологически и медицински значимые ВВССБС охарактеризованы через наборы функциональных физико-химических показателей: С,- pH|_t, -&,„ |,, Q-1 |_рн, с , о-Т^,.,' Cv-Ucp, 1/v-t ||,н. с, относящихся к разным уровням их структурной организации.

3. Впервые для ВВССБС экологического и медицинского назначения получены следующие научно-значимые результаты:

показано, что к вирионам гриппа с микромозаичной структурой поверхности и способностью поверхностных гликопротеидов к конформационным превращениям, применима модель жесткой коллоидной частицы;

поведение вируса гриппа в разных конформационных состояниях описано с позиций теории двойного электрического слоя и теории взаимодействия гидрофобных коллоидов ДЛФО (с учетом или без учета представления о граничных слоях);

показано, что генетически обусловленные конформационные изменения поверхностных гликопротеидов вирусных частиц проявляются электрокинетически;

определены времена процессов структурных превращений, происходящих в вирусных системах, которые вызваны конформационными изменения поверхностных гликопротеидов, а также изменением растворимости белковых компонентов;

4 '

доказана принадлежность Санкт-Петербургской водопроводной воды к определенному типу высокодисперсной структурно сложной белоксодержащей системы;

установлено, что высокодисперсные примеси водопроводной воды Санкт-Петербурга содержат белковые соединения и гуминовые вещества, определяющие их электроповерхностные свойства и устойчивость системы к агрегации;

установлены отличия электрокинетических свойств и поведения при агрегации взвешенных частиц мочи здоровых людей и больных мочекаменной болезнью;

Практическая значимость.

Разработанный и аппаратурно оформленный подход позволяет получать информацию о строении, свойствах и поведении водных высокодисперсных структурно сложных белоксодержащих систем, на таком уровне и в таком комплексе, которые ранее были практически недостижимы Не требующий прецизионного оборудования, сложной машинной обработки, он делает «видимыми» коллоидные компоненты высокодисперсных систем и позволяет определять индивидуальные, а не интегральные, характеристики частиц дисперсной фазы, но вместе с тем даст сведения о состоянии всей дисперсной системы и о роли отдельных молекулярно растворенных компонентов в ее поведении .

Результаты, полученные при разработке и реализации подхода, нашли применение в технологиях производства чистых вирусных препаратов и препаратов белков плазмы крови. Даны рекомендации по физико-химическому определению штаммовых отличий вируса гриппа, выбору вакцинного штамма и предпочтительной технологии очистки и концентрирования вирусов в вакцинном производстве, определению срока годности очищенного вирусного препарата. Получена практически важная информация о коллоидных компонентах питьевой (водопроводной) Санкт-Петербурга в связи с их потенциальной аллергенной и канцерогенной опасностью, о причинах устойчивости коллоидной системы водопроводной воды, об источнике попадания высокодисперсных примесей в водопроводную сеть. Выданы обоснованные экспериментально проверенные рекомендации по мембранному и адсорбционному вариантам удаления коллоидных компонентов. Показана негативная роль коллоидных и молекудярно-растворенных компонентов водопроводной воды в технологиях ее обеззараживания путем озонирования или ионообменной фильтрации через ПГС-фильтры, а также в использовании мембранной и ионообменной фильтрации в мониторинге воды по санитарно-бактериологическим показателям. Получены результаты, позволяющие рекомендовать использование предложенного подхода для разработки методики диагностики мочекаменной болезни.

І J

Результаты работы также используются в научно-педагогической практике автора при чтении курсов лекций, ведении лабораторных занятий и НИР по дисциплинам «Физико-химические методы анализа», «Мониторинг окружающей среды», «Инженерные основы защиты природы», «Коллоидная химия», «Физическая биохимия» (для студентов кафедры экологических основ природопользования инженерно-строительного факультета, факультета медицинской физики и биоинженерии, каф. биофизики физико-механического факультета), а также при руководстве курсовыми проектами, дипломными работами и магистерскими диссертациями. Апробация работы

Материалы работы докладывались на конференциях, проводимых на базе СПбГТУ («Инновационные наукоемкие технологии для России»,1995, Международная конференция «Интернационализация высшего образования и научных исследований в XXI веке: Роль технических университетов», 1999, Ш Всероссийская научно-техническая конференция «Фундаментальные исследования в технических университетах», 1999, Международный Бизнес-Форум ШТ-ХХІ «Информационные и бизнес-технологии XXI века, 1999); а также на 1-ом Всесоюзном симпозиуме по молекулярной и жидкостной хроматографии (Дзержинск, 1979,1-ой Всесоюзной конференции «Хроматография в биологии и медицине» (Москва, 1983); Всесоюзной конференции «Коагулянты и флокулянты в очистке природных и сточных вод» (Одесса, 1988); Всесоюзной конференции «Коллоидио-химические проблемы экологии» (Минск, 1990); Путинском совещашш «Культивирование клегок животных и человека. Проблемы цитологии» (Пущино, 1994); Российской конференции по мембранам и мембранным технологиям «Мембраны-95» (Владимир, 1995); П-ом съезде биофизиков России (Москва, 1999); Международных конференциях по поверхностным силам (Москва, 1985, 1990); Международной конференции «Коллоидная химия в решении проблем охраны окружающей среды» (Минск, 1994), Международных конгрессах «Вода: экология и технология» (Москва, 1994, 1996); Международной конференции «Биоколлоид 95» . (Киев, 1995); Международной научно-практической конференции «Измерительные информационные технологии и приборы в охране здоровья (МЕТРОМЕД-99)», (Санкт-Петербург, 1999); 32-nd ШРАС Congress (Stokholnv 1989); 11-th European Conference «Chemistry of interfaces» (Berline,1990); ШРЛС Congress (Budapesht,1991); 11-th International conference «Surface Forces» (Moscow, 1996); 9-th Intern, conference on Surface and Colloid Science (Sofia,1997), 10-th Intern. Conference on Colloid and Interface Science (Briston, 2000), Intern. Sympos. on Electrokinetic Phenomena (Dresden, 2000).

6 I

Публикации и личный вклад автора. Основные результаты диссертации отражены в 57 печатных работах, в том числе 5 авторских свидетельствах и 9 патентах.

Материалы, включенные в диссертацию, выполнены либо непосредственно автором, либо под руководством (или при соруководстве). Концепция разработанного подхода также принадлежит автору работы. Поименно состав руководителей, соисполнителей и дипломников, работавших по различным направлениям, имеющим отношение к теме диссертации, достаточно полно отражен в списке соавторов публикаций.

Исследования, связанные с анализом дисперсий вируса гриппа, выполнены в рамках госбюджетной тематики: «Разработка методик анализа дисперсных систем биологического происхождения». Изучение таких объектов как водопроводная вода г. Санкт-Петербурга, а также моча здоровых людей и больных мочекаменной болезнью, проводилось в порядке творческой инициативы автора.

Структура работы

Диссертация состоит из введения, 7 глав (разделов), заключения, библиографии и
приложений. Работа изложена на страницах, включая рисунков и таблиц в

основной части, а также рисунков и таблиц в Приложении.