Введение к работе
Актуальность исследования. Изучение физико-химических механизмов мотляний активности клеток крови биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия шяется важным по ряду причин.
Во-первых, хлорноватистая кислота (ионизированная форма - гипохлорит-іион) продуцируется в организме фагоцитирующими клетками в реакции, катализи-?емой миелопероксидазой. Как вторичные продукты этой реакции, при взаимодей-вии гипохлорита с биогенными аминами образуются хлораминовые производные іинокислот и родственных соединений [KlebanofT, Clark, 1978; Thomas, 1995; Weiss al. 1982; Maeda, 1991]. Гипохлорит и хлораминовые соединения могут образовы-іться при активации нейтрофилов локально в концентрациях до 0,1 мМ [Pero et al., '96]. Кроме взаимодействия с чужеродными агентами эти соединения могут оказы-іть влияние на клетки крови. Таким образом, в организме возможно межклеточное іаимодействие, заключающееся в изменении функций клеток крови под влиянием ігоцитов. Механизм действия хлораминовых соединений и гипохлорита натрия на іетки крови мало изучен. Известно, что хлораминовые производные биогенных сомнений по сравнению с гипохлоритом гораздо слабее модифицируют эритроциты и :йкоциты [Wright et al., 1986; Grisham et al., 1984; Ikuo et al., 1996]. В последнее вре-и [Park et al., 1995; Marcinkiewicz et al., 1995; Kim et.al, 1996] получены сведения о >м, что N-монохлортаурин способен снижать образование медиаторов воспаления зкрофагами (оксида азота, альфа-фактора некроза опухоли, простагландина Ег), тем імьім защищая ткани от повреждения. К началу работы в литературе практически хутствовали данные о молекулярно-клеточных механизмах действия гипохлорита и юрамининовых соединений на тромбоциты.
Во-вторых, в последнее время гипохлорит натрия, получаемый электрохими-;сюш способом, предложен [Сергиенко с соавт., 1985-1996] как детоксицирующее іедство при эндо- и экзотоксикозах и находит применение в клинике. При внутри-:нном введении гипохлорита натрия могут образовываться хлораминовые произ-)дныс биогенных соединений. В связи с этим возникает необходимость изучения одифицирующего действия как гипохлорита, так и хлораминов на компоненты кро-і; это действие может выступать в качестве побочного эффекта.
В-третьих, важно, что биогенные хдорамины, как установлено нами, оказывают .щаженное противоагрегационное действие на тромбоциты. Актуальной проблемой ияется поиск и разработка новых эффективных препаратов противотромбоцитарно-) типа действия [Кубатиев с соавт., 1980-1999; Becker, 1992; Wu, 1996]. Поэтому іучение влияния биогенных хлораминов на функциональную активность тромбоци-)в представляет интерес с точки зрения перспективы получения нового антитромбо-ггарного препарата для предотвращения тромбозов, опосредованных тромбоцитами
Цель работы - выяснение молекулярно-клеточных основ модификации струк-/ры и функций тромбоцитов биогенными хлораминами и гипохлоритом натрия; вы-зление свойств хлораминовых соединений, существенных для их использования в ічестве противотромбоцитарного средства.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1. Исследовать закономерности изменений физико-химических свойств г
функций тромбоцитов при действиии гипохлорита натрия и хлораминовых соедине
ний. В круг изучаемых свойств и функций входили агрегационное взаимодействие
тромбоцитов, сфероидная трансформация их формы, способность аккумулировать
вещества в цитоплазматические структуры, выброс содержимого цитоплазматических
плотных гранул и циклооксигеназная пероксидация липидов.
-
Выяснить зависимость противотромбоцитарного эффекта хлораминовых соединений от их физико-химических свойств.
-
Исследовать физико-химические механизмы взаимодействия гипохлорита и хлораминов с различными химическими группами мембран клеток крови. Провести оценку соотношений констант скорости этого взаимодействия в модельных системах.
-
Изучить свойства Ы,№дихлортаурина как возможного противотромбоцитарного средства.
Научная новизна работы. В диссертационной работе проведено систематическое исследование молекулярно-клеточных механизмов действия гипохлорита и хлораминовых соединений на тромбоциты, изучено действие гипохлорита натрия и хлораминов на лейкоциты и эритроциты.
Обнаружено явление ингибирования гипохлоритом натрия и хлораминовыми соединениями функциональной активности тромбоцитов, включая рецептор-зависимую агрегацию, секрецию плотных гранул, циклооксигеназное окисление липидов. Получены сведения в пользу эффективного нарушения гипохлоритом системы внутриклеточной транедукции сигнала в тромбоцитах. В результате проведенных исследований был установлен один из возможных первичных механизмов действия гипохлорита и хлораминов на клетки крови, а именно - модификация поверхностных сульфгидрильных и аминогрупп мембран этих клеток.
Показано, что изменение функций тромбоцитов происходит в результате прямого взаимодействия гипохлорита с тромбоцитами и за счет модификаций компонентов плазмы. К числу этих компонентов относятся главным образом белки и аминокислоты. Обнаружено явление восстановления нативной плазмой функциональной активности тромбоцитов, инактивированных гипохлоритом натрия. Основным восстанавливающим компонентом является фибриноген.
Для выяснения взаимодействия гипохлорита и хлораминов с различными химическими группами определены относительные константы скорости реакции гипохлорита натрия с активными группами некоторых аминокислот и пептидов, а также М,М-дихлортаурина с серосодержащими соединениями. Получено, что наибольшая константа скорости характерна для реакции исследуемых соединений с сульфгид-рильными группами.
Обнаружено, что действие хлораминовых производных аминокислот на тромбоциты в составе обогащенной тромбоцитами плазмы зависит от их структуры, молекулярной массы, молекулярного объема. Хлораминовые производные фенилаланина, глутамина, лейцина, имеющие значительную молекулярную массу (198,5-164,5 дальтон) и, соответственно, большой ван-дер-ваальсовый объем (0,169-0,151 нм \ оказывают приблизительно одинаковый противоагрегациоппый эффект. Противоагрегациоппый эффект других N-хлораминокислот резко возрастает с
'меньшением молекулярной массы соединений. Более сильное ингибирующее дейст-іие N-хлораминокислот с меньшей молекулярной массой можно объяснить их ізаимодействием с химическими группами на плазматической мембране тромбоцита, терически недоступными для соединений с повышенной молекулярной массой.
Показано, что в качестве возможного противотромбоцитного средства перфективен М,М-дихлортаурин. Он получен в твердом состоянии, характеризуется вы-окой стабильностью. Ы,Ы-Дихлортаурин оказывает широкое противотромбоцитное (ействие: угнетает агрегационную активность тромбоцитов и секрецию плотных гра-іул, вызывает дезагрегацию агрепіровашшх тромбоцитов. На кроликах in vivo пока-ано, что Ы,Ы-дихлортаурин оказывает выраженное угнетение агрегационной актив-юсти тромбоцитов в тесте с рядом агонистов: коллаген, АДФ, адреналин.
Показано, что Ы,Ы-дихлортаурин при введении в кровь человека также эффек-ивно подавляет агрегацию тромбоцитов, как и общепринятые антитромбоцитарные грепараты аспирин и тиклопидин
Практическая значимость работы. Повышенная функциональная актив-юсть тромбоцитов играет ведущую роль в патогенезе артериальных тромбозов и индрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. Для предот-ращения и лечения таких состояний может требоваться генерализованное ингибиро-ание тромбоцитов. Инактивация тромбоцитов представляет интерес и с точки зрения совершенствования способов хранения тромбоцитарной массы, так как известно, что рок хранения тромбоцитарного концентрата в обычных условиях во многом ограни-ивается постепенной активацией клеток. N-Хлорамшюкислоты, также как и ацетил-алициловая кислота (аспирин), химически модифицируют плазматическую мембра-:у тромбоцитов. Это ведет к генерализованному ингибированию функциональной ктивности тромбоцитов, то есть ингибированию их активации независимо от приро-ы агониста. Обнаруженные закономерности противоагрегационного действия хло-аминовых производных аминокислот на тромбоциты могут быть использованы для азработки нового противотромбоцитарного лекарственного средства. Потенциально озможным кандидатом на эту роль является Ы,Ы-дихлортаурин, который характери-уется значительной химической устойчивостью. Ы^-Дихлортаурин эффективно по-авляет начальную и конечную агрегацию тромбоцитов человека, и реакцию выброса одержимого плотных гранул. При введении ^Ы-дихлортаурина в цельную кровь че-овека значительное ингибирование агрегации тромбоцитов не сопровождается за-[етным повреждением эритроцитов. Важным достоинством НЫ-дихлортаурнпа сле-ует также считать его способность подавлять агрегацию спонтанно и экзогенно ак-ивированных тромбоцитов человека и вызывать распад образовавшихся агрегатов.
Полученные данные могут иметь практическое значение для оптимизации ме-ода непрямого электрохимического окисления крови, а также в клинической практи-е при разработке схем хранения тромбоцитарной массы для ее последующего пере-ивания. Результаты исследований следует учитывать при внутривенном использова-ии гипохлорита в качестве детоксиканта, чтобы избежать его вредного побочного ействия на клетки крови.
Экспериментальный материал, посвященный изучению механизмов действия ипохлорита натрия на клетки крови, вошел в работу «Разработка и внедрение элек-
трохимических методов дстоксикации в медицине», которая была отмечена Премий правительства РФ в области науки и техники за 1996 г.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1 Всесо
юзном биофизическом съезде (Москва, 1982); на Всесоюзном совещания "Биоанти
оксидант" (Черноголовка, 1983); на Всесоюзной конференции "Структурная динамик;
биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторны:
процессов" (Минск, 1988); на IV Всесоюзном съезде патофизиологов "Нарушение ме
ханизмов регуляции и их коррекция" (Кишинев, 1989); на Всесоюзной конференциі
"Электрохимические методы в медицине" (Дагомыс, 1991); на конференции "Эффе
рентные методы в медицине" (Москва, 1992); на Всесоюзной конференции «Биоанти
оксидант» (Москва, 1993); на Международном симпозиуме "Эндогенные интоксика
ции" (Санкт-Петербург, 1994); на Международном симпозиуме "Физико-химически
основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж, 1995); на симпозиумі
"Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 1995)
на Всероссийской научно-практической конференции "Озон в биологии и медицине
(Нижний Новгород, 1995); на International Symposium "Problems and trends о
photobiochemistry" (Moscow, 1997); на I международном симпозиуме "Фундаменталь
ные науки и альтернативная медицина " (Пущино, 1997); на V Российском нацио
налыгом конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1998); на V Международной кон
ференции "Биоантиоксидант" (Москва, 1998); на II Международном симпозиумі
"Физико-химические основы функционирования белков и их комплексов" (Воронеж
1998); на международной конференции "7th Erfurt Conference on Platelets" (Германия
Эрфурт, 1998); на III Съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизикої
"Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, 1998); на I
Съезде Биофизиков России (Москва, 1999); на Национальной научно-практическоі
конференции с международным участием "Свободные радикалы и болезни человека'
(Смоленск, 1999); на Всероссийской конференции "Сорбционные
электрохимические и гравитационные методы в современной медицине " (Москва 1999); на Российском Национальном конгрессе кардиологов "Кардиология, основан ная на доказательствах" (Москва, 2000); на II Российском национальном конгрессе п< патофизиологии (Москва, 2000); на IV Съезде Белорусского общественного объеди нения фотобиологов и биофизиков "Молекулярно-клеточные основы функциониро вания биосистсм" (Минск, 2000).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 58 работ. Получеш 3 патента РФ на изобретения.
Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литера туры, главы "Материалы и методы", 6 глав по результатам и их обсуждению, за ключения, выводов, списка цитированной литературы. Работа изложена на стра ницах, содержит 59 рисунков и 30 таблиц. Список литературы включает 286 найме нований работ отечественных и зарубежных авторов.
Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан, про анализирован лично автором. Часть исследований, составивших предмет диссерта ции, была выполнена при участии сотрудников лаборатории экспериментальной ге мосорбцни и окислительных методов детоксикации НИИ ФХМ, сотрудников кафед
>ы биофизики РГМУ, а также сотрудников Филиала института биоорганической хи-ши им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.