Введение к работе
Актуальность темы.
Лазерная доплеровская микроскопия. как метод высоколокального изммерения динамических характеристик сзеторассеиваюших объектов, начала свою историю с создания первого лазерного доплеровского микроскопа СЛДЮ в 1972 году CMaeda Т., Fujime S.j. Sa двадцать лет своего развития это направление убедительно показало преимущества реализации доплеровского спектрометра на базе оптического микроскопа, особенно для биофизических исследований живых объектов малых размеров, структура которых, как праввило, пространственно неоднородна, что накладывает определенные требования на локализацию измерительного объема именно в интересующих точках. Тем не менее, до настоящего зремени ЛЛМ серийно не выпускаются, видимо в силу специфики решаемых задач.
Как правило они собраны на основе современных микроскопов, имеющих точную механику, высококачественную оптику и позволяют получать пространственное разрешение с линейным размером до 1 мкм. В них используются современные методы регистрации и обработки рассеянного излучения при помощи паралельньк многоканальных спектроанализаторов и фотонных корреляторов реального зремени, автоматизированных на базе персональных компьютеров. Однако, знакочувствительного сканирующего ЛДМ, позволяющего в широких пределах измерять скорости и профили скоростей разнонаправленных нестационарных микропотокоз биологических жидкостей в живых объектах различного уровня организации, до последнего времени реализовано не было.
Необходимость реализации такого прибора продиктована важностью получения точной количественной информации о
внутренней динамике живых систем из микроскопических областей.
Приведем примеры некоторых биологических объектов жизнедеятельность которых в значительной мере определяется наличием в них знакопеременных нестационарных потоков.
Слизевой гриб Physarum polycephalum широко используется в качестве базового объекта для изучения ммеханизмов немыиечной подвижности. К обектам, имеющим амебоидную подвижность, можно сгнести собственно амм-бь:. а та:-: хі лейкоциты, сибробласты. раковые клетки. Ярко выраженную аммебоидную подввижность имеет и Physarum polycephalum на стадии плазмодия. Так же. как у аммеб у него нет специальных органов движения, но существуют, мменяющие направление, потоки протоплазмы. Плазмодий это плоская древовидная система, представляющая собой многоядерную синиитиальную массу протоплазмы, находящуюся в постоянном возвратно-поступательном движении. Во многих лабораториях мирз проводятся теоретические и экспериментальные исследования динамики этого объекта. Однако значительный круг задач остается не решенным из-за недостатка количестввенных данных, полученных с достаточной точностью и традиционно низкого пространственного разрешения - 100 - 500 мкм.
Это в равной мере относится к результатам, полученным ранее методом лазерной доплеровской спетроскопии для решения широкого круга фундаментальных и прикладных задач задач биологии и медицины где необходимо иметь средстваи зммерения скорости потоков крови в доступных прижизненному микроскопированию областях живых обектов, например, в сосудистых бассейнах холоднокровных и теплокровных животных, в капиллярах глазного яблока, в капиллярах эмбрионов рыб и др. Потоки крови как правило нестационарны, а иногда и
знакопеременны. Некоторые сосуды с противоположными направлениями потока крови пространственно близки.
Для решения подобных задач возникла необходимость создания прибора, позволяющего соединить традиционные биологические методики, которые реализуются с помощью обычного микроскопа, с возможностью измерять скорости. используя спектроскопию квазиупругого рассеяния света.
Основной целью настоящей работы является исследование динамических характеристик сложных биологических коллоидов -протоплазмы и крови, имеющих различные реологические и оптические характеристики, в ммикрообластях живых обектов разного уровня организации, в том числе при температурных и химических воздействиях. Использовались методы лазерной доплеровской микроскопии и автоматизации эксперимента. Для достижения этой цели было необходимо разработать и реализовать экспериментальную установку знакочувствительного сканирующего ЯШ. включающую систему термостабилизации объектов, систему регистрации рассеянного излучения в аналоговом режиме работы фотоприемника и з режиме счета фотонов, компьютеризированное считывание и обработку информации в реальном времени проведения эксперимента.
Основные задачи проведенных исследований заключались в
Следующем:
- на базе серийного микроскопа ЛКШМ-Р1 разработать и
реализовать знакочувствительную систему измерения скорости;
осуществить систему сканирования столиком микроскопа, автоматизированную на базе компьютера;
- изготовить термостатированную приставку к предметному столику
микроскопа для термостабилизации и температурного воздействия;
при помощи модельных экспериментов со стеклянными капиллярами продемонстрировать возможности ЛДМ как прибора;
получить временные зависимости скорости потока эндоплазмы в плазмодии миксомицета при различных условиях;
измерить профиль скорости потока эндоплазмы плазмодия;
- измерить временные зависимости скоростей кровотока в
различных точках сосудистой системы эмбрионов рыб;
- определить температурную зависимость скорости кровотока в
эмбрионе рыбы;
- измерить скорости кровотока в капиллярах брыжейки крысы.
Новизна работы.
1) В работе впервые с помощью знакочувствительного ЛДМ проведен комплекс длительных измерений скорости нестационарных потоков эндоплазмы плазмодия с пространственным разрешением, на порядок превышающим ранее достигнутое.
2D Впервые получены вертикальные профили скорости течения эндооплазмы в тяже плазмодия, подтверждены ее неньютоновские свойства.
3) Обнаружено направленное движение эндоплазмы плазмодия в направлении перпендикулярном, основному направлению потока.
4D Исследовано влияние ингибитора окислительных реакций -раствора KCN и салицилгидроксамовой кислоты, на движение эндоплазмы плазмодия.
5D Впервые получены временные зависимости скорости пульсирующих потоков крови в эмбрионе рыбы.
6D Впервые получена температурная зависимость максимальной и минимальной скоростей этих потоков;
73 Измерены скорости разнонаправленных потоков крови в прекапиллерных артериоллах, венулах и капиллярах брыжейки
крысы.
Научная и практическая ценность работы. Разработано два
автоматизированных лазерных доплеровских комплекса для
проведения исследований динамических характеристик
биологических объектов. Первый на базе отечественного оптического люминесцентного микроскопа, с управляемым ЭВМ предметным столиком, с системой регистрации рассеянного излучения, работавшей в аналоговом режиме и в режиме счета фотонов, автоматизированный на базе ЭВМ "Электроника-60" и IBM/PC-AT совместимого компьютера, С установлен в корпусе нелинейной оптики физического факультета МГУ). Второй на базе зарубежного оптического микроскопа фирмы Karl Zeiss Jena, автоматизированного на базе IBM/PC-AT с системой регистрации рассеянного излучения, работающей в режиме счета фотонов С установлен на кафедре биофизики физикоматематического факультета Университета Коменского. г. Братислава. ЧСФРЗ. Показаны широкие возможности этих приборов для изучения нестационарных динамических микроструктур in vivo и in vitro.
При помощи этих приборов, проведен комплекс биофизических исследований нестационарных потоков золеобразной эндоплазмы слизевого гриба Physarum polycephalum на стадии плазмодия. Измерены профили скорости движения эндоплазмы в плоскостях с направлением нормали вдоль основного потока и перпендикулярно ему. Подтверждены ненютоновские сзойстза эндоплазмы плазмодия. Эти измерения могут непосредственно использоваться для математического моделирования подвижности протоплазмы. Разработаны методики измерения скоростей потоков в живых системах с различными размерами рассеивателей от 0.1 мкм до 8 мкм. В частности, они могут представлять интерес для ученых.
работающих в ИБФ РАН. ИБФ СО РАН. ИБХ РАН.
Установлено изменение характера подвижности эндоплазмы при воздействии ингибиторами дыхания. Гармоническое поведение временной зависиюсти скорости эндоплазмы наблюдается только в первые 10 - 15 минут после удаления ингибитора. Различная последовательность помещения организма в ингибитор, при одинаковых начальных и конечных условиях, приводит к различному динамическому состоянию эндоплазмы.
Временные зависимости скорости крови в эмбрионе рыбы Salmo salar демонстрируют неравномерное уменьшение скорости за ввремя цикла сердечных сокращений. Изменение температуры воды, в которую помещен эмбрион Salmo salar, приводит к постепенному росту максимальной скорости пульсирующей крови. Минимальная скорость при этом меняется мало, но существует критическая температура, после которой начинается патологический процесс частичного возвращения артериальной крови в сердце во время диастолы. который характеризуется наличием отрицательных скоростей.
Апробация работы н публикации.
Полученные результаты опубликованны в 13 печатных работах, докладывались и обсуждались на IV советско-чехословацком семинаре "Динаміка и активность биологических макромолекул: лазерный и компьютерный эксперимент" СЕрезан, 1988), II-ом Всесоюзном семинаре "Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медшине" СТарту, 1989). Всесоюзном семинаре "Измерения в потеках. Методы, аппаратура и применения" С Москва. 1990), Всесоюзном семинаре "Лазеры в народном хозяйстве" СМосква, 1990). 3-ей Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" СМосква. 1990). Международной
конференции "Новое в лазерной медицине и хирургии" СПереяславль-Залесский, 1991), первой Всесоюзной конференции "Оптические методы исследования потоков" (Новосибирск. 199D. Международной школе NATO Advanced Study Institute "Structure and Dynamics of Supramolecular Aggregates and Strongly Interacting Colloids" СМаратеа. Италия, 19913, 35-ом Международном симпозуме "Optical Applied Science & Engineering, Laser Interferometry IV: Computer-Aided Interferometry" ССан Диего, США, 1991), Российской молодежной ассамблее "Молодежь и здоровье" С Саратов, 1992}, 4-ой Международной конференции "Laser Applications in Life Sciences" СЕваскула, Финляндия. 1992), 6-й Международной конференции ECIS /European Colloid and Interface Society/ С Грац, Австрия. 1992).