Динамика биополимеров в растворе и метод спин-метки Тимофеев, Владимир Петрович

Рис.6 Модель быстрых осцилляции нитроксильного радикала.
X, Y,Z- молекулярная система координат нитроксила.
X^і, T,Z' - лабораторная система координат или система координат, жестко
связанная с макромолекулой. R - ось колебаний. Н - направление
магнитного поля. а,р,у - углы (также как и углы 0,Ф), определяют положение
оси R в системе X, Y,Z, вокруг которой колеблется широкой, а - угол
колебаний нитроксила. ^1 = (з cos¹9 -1) / 2, к = tg(45 - ф)

Л_я=[*1+ |-t,-(2.S|+l)

Лиг ' "т + 4r ' "^r ⁺ 4zz *Az

)](2-^

+ 1

(19')

+ f A:₄-((2-^+1)-^+(2-51+1)-^]

= [*i

+ i.*j.(2.J*+l)

(20')

Ajj =

+ f*« -((2- +lMa +(2-51+1)-^] /1:,+ | -*, -(2-5|+1)].^ +

+ з-*з

_fl„+|-(Ar -^+^ -5*+Л_в -5|) .(2-. +1) +

(21')

+ f*4-((2-^+0-^+(2-+0-^]

2.3 Из этой общей модели усреднения диагональных компонент тензоров Aug, определяемых формулами (19',20',2Г) легко получить частные случаи.

Рассмотрим первый случай -колебание нитроксила от -тс до тс, что соответствует модели быстро вращающегося волчка. Тогда формулы (19',20',2Г) с учетом (15),(17) и (22) для а=7с можно записать следующим образом:

^я=в.+1(^-^+^-^.+ ^-^)-^ = ^.+1-^-^:

a„+-AA -Sy

(23)

Avy + "V ' Ayr + O_z Л/

An ~^ас ⁺Х\^Х ' —лл -і --її -& "и, І -1 -а -,

Azz =0. + \{s*-A_{n +}Sf -А_{п +} S» -A_a).S> = a₀ + |-Ґ -S* -

Все входящие сюда величины выражаются также, как и формулы (4') и (6'), с подстановкой вместо параметра упорядоченности S_z оси 2 нитроксила параметра упорядоченности S оси Д, например:

&А* = bA-S-SA-(l-S)-K (24)

Как видно из (18) колебание нитроксила от -тс до л не приводит магнитные тензора к аксиальной симметрии и лишь при к = 0, когда согласно (8) и (9):

St=S?=-& (25)

формулы (18) сводятся к аксиально-симметричному виду:

(26)

A, = a.+f&A.{s*)\ A=a,-\-AA.{s*)¹ .

Из формул (26) следует (принимая во внимание, что — АА = А_г - а_с) формула для

з'

параметра упорядоченности S (см.(б')):

_{s =} AzA- ₌ Az^ ₌ (s«f ₍б")

т.е. во второй модели усреднения в аксиально симметричном случае экспериментально определенному параметру упорядоченности S уже ставится в соответствие величина теоретического параметра упорядоченности оси Л в квадрате, т.е. \S%) . Это очень важный впервые полученный вывод [70].

Рассмотрим второй частный случай - колебания системы координат X, Y,Z вокруг той или иной оси X,Y,Z , т.е. формулы (14,15,16) соответственно преобразуются в хорошо известные формулы (см., например, Griffith).

Так при с, = 1 или S =1 в-.

^Ахх = (^1 + 2^₂ + ЛГ₃) Да = Л*

1_п = К, .А_п + ЛГ< -А_{а =}^Arr^A_zz+A_n-^A_2Z sinja _(2?)

~а - v a j- v л - ^zz ⁺ Апт , -^zz ~ 4т sin 2а
^ли ~ ^Лі '^A2z + ^л4 ^лп - 1Г- ⁺ 2 2

При с₂ = 1 или Sy = 1 в:

!„. =(^,+2^+tf₃)-4r = Аг (28)

4zz + 4tr , 4zz ~ 4tr Sin 2а
2 2 ' 2а

4z - Л, % + Л ₄ уЭ_и -

При с₃ = 1 или S% = 1 в:

-r_„. j. ї" J _ 4cr ⁺ -"it , 4tr ~ 4r ^sln 2ct

^лЯ" - ^л1 '^ЛГГ ^{+ л}4 '-^IT ~ ⁺ X 2

А_п =К>:А„ +К<.А_и = ^А"- *^А" +^ЛїГ \^ЛхХ -^~ (29)

4z - (K_t + 2К₇ + К_г)Ая = 4z

Соответствие теоретических величин S_z или (S) экспериментально

полученной величине S выявляется лишь в том, что только экстремумы КШП совпадают в обоих теоретическом и экспериментальном спектрах. Этому соответствует наиболее вероятное состояние для нитроксила спин-метки, дающее моноспектр ЭПР с КШП. В этом случае расстояние (2А') соответствует {2А')

Таким образом, все многообразие теоретических моделей, имеющихся в литературе, можно свести к двум основным моделям, представленным выше. При этом, во всех случаях сдвиг КШП в спектрах ЭПР из-за быстрой переориентации метки должен быть равен:

A^s = 2А₂ - 2 J (30)

Это означает, что большое количество скачков нитроксила из-за рельефа на поверхности биополимера и химической структуры спин-метки группируется в некотором направлении, фактически задавая наиболее вероятное направление псевдооси (директора) преимущественного вращения оси Z нитроксила или колебания всей молекулы нитроксила. Переключатели S и к служат для математического описания существования других возможных направлений "псевдоосевых вращений" нитроксила, принимая во внимание весь ансамбль спин-меченых макромолекул.

Равномерное распределение скачков вокруг директора обуславливает за временные ворота метода аксиальную симметричность частично усредненных тензоров. Временные ворота, как известно, задаются анизотропией Aug тензоров, что схематически можно представить прямоугольным окном со сторонами АА = А_г-А_х и Ag = g_x -g_z, переведенными в шкалу времени, как 10 и 30 не соответственно для Х-диапазона и для 2-мм диапазона 10 и 2 не.

Таким образом, быстрая хаотическая либрация нитроксила относительно молекулы белка такова, что оставшаяся после частичного усреднения тензоров их анизотропия фактически является тем инструментом (временные ворота), с помощью которого определяется т макромолекулы. Чем больше компоненты тензоров будут усреднены (или чем больше величина S будет отличаться от 1), тем меньший диапазон т, отсчитываемый от предельной величины 1000 не, доступен измерению. На рис.7 приведены теоретические "температурно-вязкостные" зависимости, которые нужно сравнивать с экспериментальными, для расстояний между КШП (2А') в иммобилизованных спектрах ЭПР, симулированных на ЭВМ. Постоянная величина S для каждой прямой соответствует постоянной температуре меняется только т при изменении вязкости раствора т|. Из эксперимента следует, что получение зависимости величины 2А' от вязкости при постоянной температуре является необходимой основой для расшифровки спектров.

В принципе невозможно теоретически предсказать вклад в общее частичное усреднение тензоров отдельно от величины т или от величины S.

Осевое вращение радикала приводит фактически к двухкомпонентному тензору. Либрационное движение нитроксила, как частный случай, может включать колебательное движение, приводящее к трехкомпонентному тензору. Самое простое из таких движений это вращение вокруг осей молекулярной системы координат. В этом случае формулы усреднения будут следующими (см. также формулы (28)):

А_у=А, (31)

A_z=A_x+±^-P

2000 (ns) 20

(_т-0.74)х100

Рис.7 Теоретические "температурно-вязкостные зависимости" расстояний между экстремумами КШП (2А'). Повышение температуры снижает параметр S. Повышение вязкости раствора увеличивает время вращательной корреляции т макромолекулы.

„ , sin 2a ,--.

где: P = 1 + — (32)

Таким образом, обе модели, описывающие частичное усреднение компонент тензоров, представляются, как частный случай более общей модели поведения нитроксила, соверщающего колебания на угол ±а вокруг оси R, положение которой задается ее направляющими косинусами или параметрами S и к (см. Рис. б).

2.4Наиболее вероятная величина параметра S определяется только экспериментально по предложенной здесь оригинальной методике, дающей возможность оценить броуновское вращение макромолекулы (или ее доменов), несущей метку. В Табл.1 была показана схема температурно-вязкостной зависимости расстояний между эктремумами КШП. Линейность этих зависимостей в указанных координатах при больших вязкостях нарушается, поскольку нарушается условие быстрых переориентации нитроксила. Продолжение линейных зависимостей до пересечения с осью ординат дает величины 2А, по которым рассчитываются параметры S для каждой температуры.

Величина параметра S, равного величине S_z для модели вращения оси Z нитроксила или равного величине \S%) для модели осевого вращения нитроксила, как целого, определяется экспериментально только по положению экстремумов КШП. Тем не менее форма линии КШП и центральной части спектра описывается набором значений S и к. В ранних работах теоретически параметр S представлялся как произведение двух других параметров упорядоченности: S^, относящегося к ориентации оси преимущественного вращения оси Z нитроксила по отношению к осям X',Y,Z', и S_m, относящегося к переориентации оси Z нитроксила в объеме конуса с раствором угла при вершине 2а и осью, совпадающей с Z', то есть:

S = S„..S„ (33)

При этом параметр упорядоченности S определялся как:

S„=(3coa2\-l)/2 (34)

где \ - угол между осью Z', неподвижно связанной с макромолекулой, и осью конуса, а параметр упорядоченноси S как:

S_K0H = (cos²a + cosa)/2 (35)

где a - половина угла при вершине конуса, в котором переориентируется ось Z нитроксила ( 0 < a < 90 ).

Введенная конкретизация быстрого анизотропного вращения нитроксила позволяет наглядно пояснить существование гетерогенности формы линии экспериментального спектра и ряд других его особенностей, как результат случайного характера переориентации нитроксила, приводящего к распределению плотности вероятности параметра S от угла \ (модель "пшеничного поля", Griffith, 1975) и параметра S от угла раствора конуса 2а, принимая во внимание пределы изменения параметров упорядоченности, входящих в формулу:

(-1/2 < S <1) = (-1/2 < S„ <1) (0 < J„. <1) (36)

Из формулы (14) видно, каким образом вводится в рассмотрение разброс в величине S по ансамблю спин-меченых макромолекул. Разброс характеризуется числом возможных быстрых переориентации спин-метки, ограниченных временными воротами, задаваемых анизотропией СТС и g-фактора радикала, который и приводит к различию в характере усреднения компонент обоих тензоров.

Оба стохастических процесса (медленный и быстрый) происходят одновременно и ввиду их независимости аддитивно производят сдвиг КШП в спектрах ЭПР. Ввиду этого мы приходим к тому, что суммарный сдвиг КШП нужно представлять в виде:

A = 2A_Z - 2Л' = {lA_z -2а) + (2Л- 2А') = Д⁵ + Д^т (37)

где: h^s и Д* есть выражения (30) и (5), полученные выше, при рассмотрении влияния каждого из двух стохастических процессов на сдвиг КШП.

Сдвиги А⁵ и Д* легко определяются из температурно-вязкостной зависимости, представленной в Табл.1. Для спин-зондов имеет место обратный загиб изотерм при больших вязкостях.

Подстановка частично усредненных, аксиально симметричных тензоров g и А в стохастическое уравнение Лиувилля (J.Freed) для описания броуновского движения нитроксила, с последующим вычислением ЭПР спектров, приводит при соблюдении постоянства шпура для обоих тензоров к функциональной зависимости сдвигов КШП в спектре от х макромолекулы и параметра упорядоченности >?(см.Рис.8):

T-S = a-(A¹/S)^b (38)

где: S = 5„„ (см.(6)), то есть

^{т A}z - A A_z- а₀ A_L - а„

Коэффиценты а и Ь находятся из теоретических номограмм (Рис.8) методом наименьших квадратов. В результате получен ряд формул:

fS=-.l97-(A^z/s)'^U> _ (39)

в диапазоне 10 не < т < 2000 не, с 5Я=ЗГс,

х-5 = 80-(д^т/-уГ (40)

в дипазоне 5 не < х < 10 не для КШП и

т-.У = 85-(д7.У)^³ (41)

в диапазоне 5 не < т < 40 не и 0,5 < S < 0,8 для ВШП.

Модель количественно точно описывает положения КШП в спектрах ЭПР, а также качественно выявляет некоторые основные особенности формы линии центральной части спектра при определенных условиях, легко осуществляемых на практике. Благодаря этому создается возможность получать, как в методе спин-метки, так и в методе спин-зонда однозначную информацию.

s~

1.0

,G

s-

o 1.0 n0.9 z^O.8

0.1

100 T,ns

Li—'-lull I .1-1-1 1 l l t l I l r l t r . | , t . . . , , ^ , , ,

Рис. 8 Номограмма по определению времени вращательной корреллщм макромолекулы из величины сдвигов КШП (л^т = 2А - 2А') и

ВШП (ДІ = 2A_L -2А[) и величины параметра S.

Следствия, вытекающие из предлагаемой модели, следующие:

1. Если параметр S=l, то метка "жестко" связана с белком. При этом может сохраняться быстрое вращение оси Z нитроксила вокруг оси Z', или иначе должна сохраняться переориентация оси Z нитроксила в пределах конуса с углом при вершине в 20 (или с S=0,95). В результате экспериментальная линейная зависимость (Табл.1) 2А' от (ТІ г})' с увеличением вязкости среды при постоянной температуре должна стремиться к величине максимально возможной величине 2А_Х (т.е. к 2А = 2A_Z ) с наклоном, задаваемым величиной т.

2. Если параметр S<1, то линейные зависимости (Табл.1) 2А' от вязкости должны располагаться параллельно со сдвигом, зависящим от величины S, и иметь характерное отклонение вверх (загиб) в области больших вязкостей для спин-меток и отклонение вниз для спин-зондов, а при экстраполяции прямолинейных участкоЕ давать величины 2А.

3. При т>2000 не сдвига A^s практически нет, поэтому наклон изотерм должен отсутствовать (Табл.1). При больших вязкостях прямые параллельные оси абсцисс пересекаясь с осью ординат, должны давать 2А. Эти точки пересечения можнс получать экспериментально путем связывания спин-меченого белка с адсорбенте» или используя сшивающий белки реагент.

4. При т<5 не в спектрах ЭПР спин-меченых макромолекул КШП должнь отсутствовать уже при 5=0,8.

5. Ширина крайних широких пиков, особенно высокопольного, превосходит, і зависимости от температуры и вязкости среды, ширину индивидуальной линии ЭП1 сигнала нитроксила в растворе в 2-3 раза, что является следствием суперпозицш спектров ЭПР.

Все эти следствия подтверждаются экспериментально на большом количеств разных биологических образцов.

2.5 Существование быстрой переориентации радикала относительн' макромолекулы к настоящему моменту подтверждается, многочисленными данным: ЯМР спектроскопии, поляризации люминесценции, рентгеновской спектроскопии. ] результате присоединения спин-метки к концу того или иного аминокислотног остатка белка, боковая группа удлинняется, а спин-метка подвергается еще боле интенсивному стохастическому процессу, приводящему к укорачиванию анизотропной переориентации нитроксила по сравнению с т немодифицированно концевой группы. Величины т атомов боковых групп по данным ЯМ спектроскопии, например, для ингибитора трипсина сотавляют от 0,01 до 0,4 не.

В случае длинных полимерных молекул синтетического или биологическої происхождения сегментальная подвижность полимера рассматривается аналогичн изотропному движению глобулярных белков. С помощью метки, связанной с бокове группой полимера, измеряется изотропное в первом приближении эффективне

время вращательной корреляции сегмента полимера и характер подвижности боковой группы. Но есть характерное отличие - метка равновероятно присоединяется по длине полимера (в середине или на его концах) и поэтому будет иметь разную амплитуду переориентации. Следовательно, в зависимости от положения метки на регулярной полимерной цепи спектр ЭПР спин-меченого полимера будет отражать некое распределение величин т и S. В результате это должно приводить к уширению пинии в суммарном спектре из-за суперпозиции спектров, от каждого кластера (или скопления спин-меток), каждый из которых соответствует одному определенному набору параметров т и S.

Спектры ЭПР нитроксильных радикалов чувствительны не только к молекулярным движениям, но и к полярности среды, в которой они растворены, а гакже к динамике образования водородной связи. Как правило, метки, модифицируя боковые группы биополимеров, экспанированы в раствор, поэтому величине а₀ радикала будет постоянна и соответствовать полярности водной среды. Наличие водородной связи радикала с молекулой воды через >N-0 группу или с другими протонодонорными группами белка может значительно увеличивать величину а_а радикала. Это увеличение тем больше, чем больше время существования водородной :вязи.

Известно, что нитроксилы с пиперидиновым и пирролидиновым циклом имеют эазную структуру. Для нитроксилов с 5-ти членным циклом существует плоская ганформация, с 6-ти членным циклом конформация "кресло", в которой угол между :вязью >N~0 и плоскостью нитроксильной группы составляет 17. В динамическом :остоянки происходит быстрая инверсия "кресло-кресло", которая приводит к гобавочному уширению линий в спектрах ЭПР. Наличие водородной связи с >N~0 -руппой нитроксила или нахождение образца при низкой температуре, начиная с -100 С и ниже, уничтожают инверсионный процесс.

3. Процедура проведения эксперимента методом спин-метки

1. После получения спин-меченого образца и записи его ЭПР спектра в 5уферной среде при комнатной температуре, расшифровку спектра нужно начинать с эксперимента по изучению его формы линии от вязкости среды, при постоянной температуре путем добавления сахарозы, поскольку из одного единственного жсперимёнтального спектра невозможно получить корректно информацию о шнамике поведения метки и ее носителе. Для однозначной расшифровки жспериментальные спектры должны содержать КШП. Если таковых нет при емпературе 20С, то необходимо снижать температуру вплоть до 0С. Если и при >той температуре еще нет ярко выраженных КШП, то необходимо добавлять сахарозу К> тех пор, пока они не начнут появляться.

2. Для определения главных компонент магнитных тензоров g и А предлагается следующая процедура. Записать спектр ЭПР от свободной спин-метки в

буфере при концентрации не более 10 Ми, измерив расстояние между крайними острыми пиками, определить 2а„. Записать спектр ЭПР образца при 77С, чтобы из этого "порошкового спектра" определить 2A_Z и найти сумму: (А_х + А_г) = Зд₀ - A_z. Из этого же спектра определить g₀, вычислив первый момент спектра (Pilbrow, 1980). Далее, принимая g_z=2,0022 и зная g„ легко получить другую сумму: (g_x + g_r) = 3g„ - g_z. Далее величины g_x и А_х подбираются в процессе симуляции

спектров.

3.3 Записать при постоянной температуре спектры ЭПР образцов, в которых создается различная вязкость, путем добавления сахарозы. Из спектров измеряется 2А', расстояние между КШП, и строится зависимость этого расстояния от (Т/г\)' .

Из этой зависимости определяется необходимые динамические параметры в том числе 2А и параметр S, рассчитываемый по формуле S = (А - a₀)/(A_z -о„)> а затем

рассчитывается время корреляции х по формулам (4, 39-41), считая величину S, найденную по экстремумам КШП, как наиболее вероятную.

4. Процедура симуляции ЭПР спектров Как упоминалось выше однозначное моделирование ЭПР спектров спин-меченых молекул возможно лишь в том случае если из эксперимента определены величины тк S. Далее поступают следующим образом:

Р(Г

(41)

3. Необходимо выбрать сначала одну из моделей усреднения диагональных компонент обоих тензоров. Таких моделей две: аксиально-симметричная и колебательная, т.е. , соответственно, вращение оси Z нитроксила и колебание всего нитроксила относительно оси преимущественного вращения. Выбор модели проверяется при однократной симуляции спектра для величин S и т, подбирая компоненты тензоров, ширину индивидуальной линии и величину к. Затем для каждого случая рассчитывается набор спектров ЭПР, каждый из которых соответствует определенному кластеру. Кластер сответствует одному типу нитроксильных радикалов из всего ансамбля спин-меченых молекул в образце, е котором все радикалы имеют одни и те же величины S и к.

4. Плотность вероятности распределения кластеров представляется в виде Гауссовых распределений:

ст_аЛ

Рп~Є

(42) р.. - вес соответствующего ij-кластера в суммарном ЭПР спектре прі

фикированном угле осцилляции а. Величины S, и к„ определяют положение осі

преимущественного вращения нитроксила в системе координат связанной с глобулой белка (см. Рис.5,6).

р_п - вес соответствующего п-кластера в суммарном ЭПР спектре при фиксированных величинах 5„ и к„. а₀ - величина наиболее вероятного угла осцилляции нитроксила.

Тогда теоретический спектр ЭПР представляется в виде:

*L = Хр*-ЗФ,.Ку) ij

SC = EP. *(«.) (43)

ЗРш = H, E w, Sp'_a ці_г I «r, S/C

Ц, -t-H, =1

»„ - есть симуляционный спектр, полученный суммированием по большому числу кластеров. Этот спектр уже передает все особенности экспериментального спектра. Параметры распределений подбираются в процессе симуляции.

5 Сравнение трех методов изучения вращательной релаксации макромолекул и динамических параметров их боковых групп

В данной главе проводится сравнение метода спин-метки с методами поляризации люминесценции (Табл.1) и ЯМР, которые применяются к изучению вращательной релаксации макромолекул [37]. Для этого необходимо кратко привести основные соотношения и уравнения, использующиеся в методах.

5.1 В методе поляризации люминесценции, при параллельной и перпендикулярной ориентациях красителя по отношению к падающему поляризованному свету для случая жестко связанного красителя с неподвижными хаотически распределенными глобулами белка, величины /„ и I_L соответственно являются компонентами интенсивности испущенного поляризованного света. Если размораживается связь красителя с белком, то за счет быстрой, ограниченной по >тлам переориентации красителя обе компоненты, частично усредняются и ггановятся равными величинам /„ и 1₁. Если в свою очередь размораживается и эроуновское движение молекул белка, то обе компоненты уже становятся величинам :о штрихом /,', и I[ .

Тогда степени поляризуемости красителя определяются как:

р - " ~ * р - " ~ '* Р' - " ~ 'Ї (ЛЛ\

/,, + // /. + // "/,;+/; ^{{ }}

При этом максимальная амплитуда быстрой угловой переориентации красителя

этносительно молекулы белка характеризуется величиной:

Y.UZzlll (45)

1/^» -1/3 ^{V ;}

Величина Р определяется непосредственно из эксперимента, а величина Р определяется путем экстраполяции линейной части зависимости 1/Р'от Т/т| при г)—>оо. Аналитически эта зависимость представляется уравнением Левшина-Перрена-Вебера, в которое входит время вращательной релаксации р=3т и время жизни возбужденного состояния красителя т₀:

В табл.1 (нижний рисунок слева) приведен характерный график зависимости —

от вязкости раствора, в котором находится иммуноглобулин G, меченый красителем Экстраполяционную величину Р на графике можно представить в безразмерною виде:

У = ^J-fzT-- (47)

И не случайно вид этой формулы аналогичен формуле для параметр; упорядоченности S, см. (6'). Величине Y можно сопоставить некий угол, в KOTOpOV происходят быстрые колебания красителя.

Таким образом, в обоих методах графики зависимости текущей величины (—

или 2А') от вязкости раствора при постоянной температуре сходны, а из аналитические выражения эквивалентны. Обе зависимости отражают общую и самук главную закономерность "вращательного" движения репортерской группы - красителі или спин-метки - участие в двух независимых стохастических процессах угловоі переориентации: быстром анизотропном относительно глобулы белка и медленнох изотропном вместе с белком. Действительно, работа [21] по применению обои; методов к иммуноглобулинам А и М подтверждает теоретический подход.

5.2 В методе ЯМР, при рассмотрении поведения боковой группь макромолекулы, прибегают к аналогичному подходу при интерпретацю экспериментов по ЯМР релаксации того или иного ядра в составе этой группь [Lippari, Szabo, 1983 и Федотов В.Н, 1978, 1985]. Магнитная релаксация концевоп ядра в боковой цепи макромолекулы определяется угловыми флуктуациями вектор; концевого звена "метки". Очевидна аналогия со спин-меткой, присоединенной і концевой группе бокового радикала. Если величины эффективного времен] корреляции (т_м) процесса переориентации этого вектора относительні макромолекулы и времени вращательной корреляции (т) самой макромолекулі удовлетворяют условию: т„ « х, то можно оба процесса считать независимыми ] представлять общую корреляционную функцию всего процесса переориентаци вектора относительно лабораторной системы координат (X,Y,Z) в виде произведения

C_B(t) = C(t)-C„(t) (48)

где:С(0 = |-Г^ (49)

корреляционная функция изотропного движения макромолекулы, а

С«(0 = 1а,-^« (50)

корреляционная функция анизотропной угловой переориентации вектора концевого звена относительно системы координат (X',T,Z'), жестко связанной с макромолекулой.

Форма представления корреляционной функции (49) в виде экспоненты является общей и для методов спин-метки и поляризации люминесценции. В то время как функцию (50) необходимо представлять серией экспонент, если сложное движение вектора описывать марковским стохастическим процессом. Точный вид этой функции будет зависеть от той или иной выбранной модели движения вектора. Поэтому, используя безмодельный подход, можно резко упростить задачу, представляя функцию (50) в следующем виде:

C„(t) = S²+(l-S²)-^", (50')

начальное (при t=0) и ассимптотическое (при t=) значения которой не зависят от модели быстрого движения метки. В аксиально симметричном случае веліяина S имеет смысл параметра упорядоченности, такой же как и в других методах.

Комбинируя уравнения (48), (49) и (50'), легко получить общую корреляционную функцию:

c;W = i.s^J.^₊|-(i-s²K4 (51)

где^¹ =х"¹ + т_м¹.

Таким образом, в ЯМР экспериментах по протонной релаксации движение концевого вектора боковой группы в молекуле белка описывается аналогично тому, как в ЭПР методе движение спин-метки на конце аминокислотного остатка описывается тремя эффективными величинами: t, S и т_м. Но если в ЭПР методе величины т и S оцениваются непосредственно из эксперимента, то в ЯМР методе эти величины находятся из выражения для спектральной плотности, соответствующей корреляционной функции (51):

(52)

/(к

5\1 ₊ (шх)²⁺ 1 ₊ (_Ит,)² J*

через которую в свою очередь по известным формулам выражаются экспериментально полученные времена продольной и поперечной времен релаксации (Т(, Т₂) и величина ядерного эффекта Оверхаузера. Определяя экспериментально эти величины, вычисляют величины т и т_м с помощью фурье-преобразования. Эту довольно громоздкую процедуру можно также как и в двух предыдущих методах осуществлять в случае наблюдения за релаксацией ядер в зависимости от вязкости среды при постоянной температуре.

Во всех работах по ЯМР, в которых определяются величины т. и t_M, легко видеть, что диапазоны их изменений равны, соответственно, от 2 до 160 не и от 10 до 160 пс при нормальных условиях. Разница метода ЯМР по сравнению с ЭПР состоит лишь в том, что число переориентации метки за временные ворота одного метода по сравнению с другим в 20-100 раз больше. К. этому нужно добавить, что в методе ЯМР-релаксации протонов наблюдение неизбежно проводится сразу за всеми протонами внутренних и внешних боковых групп, что приводит к несколько завышенным величинам т.

Таким образом, симуляция спектров ЭПР является необходимым инструментом получения дополнительных статических и динамических параметров, строгим доказательством правомерности выбранного теоретического подхода.

б. Материалы, методы и полученные результаты по каждому объекту исследования.

В этой главе дается список всех объектов, исследуемых в данной работе, а также все спин-метки, представленные в Табл.2 и 3.

Основной метод - ЭПР спектроскопия. Использовались методы импульсной и стационарной поляризация люминесценции, видимой и УФ спектроскопии, метод кругового дихроизма.

Ферменты: Ь-Аспартат-2-оксоглутарат-аминотрансфераза (ААТ, трансаминаза) -фермент (КФ 2.2.6.1), молекула которого состоит из двух субъединиц с мол.весом 90000 Дальтон. Пиридоксаль-5'-фосфат - кофермент. Впервые установлено, различие в динамических свойствах изоэнзимов аспартатаминотрансферазы, полученных из сердца свиньи и курицы [4-9,45]. Обнаружена гибкость не только димера молекул этих ферментов, но и составляющих ее мономерных субъединиц. По спектрам ЭПР ковалентно присоединенных спин-меток обнаружено обратимое локальное конформационное изменение в районе остатка Cys-45 мономера аспартат аминотрансферазы на стадам образования комплекса Михаэлиса. Моделирование спектров на ЭВМ показало, что конформационное изменение связано с ограничением объема, в котором переориентируется метка, из-за сдвига малого домена. С помощью спин-меченых аналогов витамина Bg (Табл.3) проведена оценка расстояний от SH-группы остатка цистеина-390 фермента до центра, связывающего а-карбоксильную группу (5 А), и до кольца пиридина кофермента (8А).

Фосфорилаза Б. Впервые детально проанализирован процесс связывания субстратов ингибиторов с ферментом фосфорилазой Б по наличию локальных конформационных изменений в белке [20]. Проведен анализ сложных по форме экспериментальных спектров путем сравнения их с моделированными на ЭВМ спектрами, доказывающий существование в них суперпозиции, и показано, что добавление ппокозо-6-фосфата угнетает подвижность только одной из двух SH-rpyrm, алкилированных спин-меткой на основе йодацетамида, в обоих мономерах белка.

N О"

N

О'

NH₂ JCH₂-C-NH

N М О

J—L ^N \

0=^4^= HN^Q^N JCH₂-C-NH-CH₂-C

N О

i, О

NH

0=к.,>=0

JCH₂-C-NH

HN-Д N JCH₂-C-CH₂ CH₃
H=( U—— M

N' "10 11 ^>

о о

HgCI

HgCI

^{^ K}₀

== N ==N =N

^N^14 ^^15 ^N^C=CH₂ 16
О О О' HgCI

Таблица 2 Спин-метки

ноос-сн-сн₂-сн₂-соон

нсо но-росн₂Л _он

N "CH-:

N-0

ноос-сн-сн₂-сн₂-сн₂--соон

N СН₃

но-росн

N СН₃

Таблица 3

Спин-меченые аналоги пиридоксаль-5'-фосфата

Рибулозофосфат карбоксилаза; Протеинкиназа. Обнаружены два типа SH-rpyim, обладающих разной подвижностью относительно белка в протеинкиназе и рудифкарбоксилазе. Существование подобных типов есть следствие белков с четвертичной структурой [28,36,30,35].

Сывороточный альбумин быка (САБ) - белок сыворотки крови, молекула которого состоит из одной субъединицы с мол.вёсом 67000 Дальтон (Lowson, Serva, Fluka). На этом белке проверялись все типы спин-меток, алкилирующих SH-группы. Впервые новый подход применен для расшифровки спектров ЭПР спин-зондов карболинового и бензокарболинового ряда, адсорбированных на молекуле сывороточного альбумина [15,23]. Доказано существование быстрой ограниченной по углам переориентации спин-зонда, адсорбированного на гидрофобном участке альбумина. Показано в частности, что набор далеко отстоящих друг от друга прямолинейных участков в температурно-вязкостных зависимостях обусловлен частичным усредне-нием магнитных параметров за счет быстрой переориентации зонда, сохраняющему полярность водной среды. Показано, что ртуть содержащие спин-метки ковалеіггно связываются в две стадии с цистеиновыми остатками молекулы сывороточного альбумина в растворе [37,64]. Быстрый процесс происходит за время меньше 1 млсек, а медленный за 40-60 млсек обусловлен дополнительным конкурентным процессом связывания радикала с гидрофобной площадкой белка. С помощью спин-меток разной' длины, присоединенных к одной и той же SH-rpyime БСА, установлено постепенное увеличение гибкости молекулы БСА при снижении рН от нейтральных значений до рН2,5 и одновременное увеличение стерических ограничений со стороны белка движению цистеинового остатка [37]. Показано также, что частичное усреднение магнитных параметров связано с изменением объема вращения радикала, увеличивающегося с его длиной, а не с изменениями полярности окружения нитроксила. С помощью спин-метки длиной в 14 А установлен факт близкого расположения гидрофобной площадки белка к его SH-rpynne [25].

Белки главного комплекса гистосовместимости классов I и II. Введением спин-меток по пептидной и углеводным частям белков определялось их время вращательной корреляции. Подтверждена определенная гибкость структуры белков обоих классов.и выявлено, что белковая часть белка намного превосходит ту часть белка, которая содержит углеводную компоненту [49,50,56].

Нейротоксин. Сгаш-метка 3 в Табл.2. Впервые на количественной основе проведена оценка подвижности спин-метки на пяти лизиновых остатках и измерено время корреляции белка [33]. Остатки Lys-25 и -26 самые иммобилизованные, Lys-44 и Lys-45 самые подвижные, а остаток Lys-15 имеет промежуточную подвижность.

Иммуноглобулины G, А и М и их фрагменты. Спин-метки 3,6,8 в Табл.2. Раскрыты новые в качественном и количественном отношении потенциальные возможности метода спин-метки, позволяющим решать целый ряд биологических

задач недоступных для ранее используемых методов. Степень подвижности домен различна, если он находится в составе Fc-области или Fc-фрагмента того или иног< класса иммуноглобулинов [12,47-49]. Динамическая структура Fc-фрагмент проявляется еще и в том, что СООН-концевой домен pFc' тяжелых пептидных цепеї также обладает гибкостью, включая составляющие его домены. Исследована сложна динамическая структура молекулы иммуноглобулина М [42,59]. Показано, что результате необратимого конформациошюго перехода при рНЗ происходи уплотнение структуры ИгМ в основном за счет F_c 5 -области, сопровождающееся локальными конформационными изменениями в Fab-области, что проявляется большей подвижности углеводных групп в Fab-области, чем в F_c 5-области, где метк прикреплена к домену С_ц3. Структура F_c 5 фрагмента, выделенного из ИгМ

становится более лабильной по сравнению с интактной молекулой, как в пептидной так и в углеводной части белка. Из анализа спектров ЭПР спин-метки, селективні введенной по единственному углеводному остатку Fab-области молекулы IgM установлено, что он обладает высокой пространственной мобильностью [54] Установлено различие в гибкости молекул IgG прецидитирующих і негфецигаггирующих антител свиньи с помощью спин-метки на основ триазинилхлорида, которая для этого белка связывается с его активным центром Обнаружен и исследован медленный (в течение нескольких минут) процес обратимого конформационного изменения в молекулах антител из свиньи (клао IgG) после быстрого добавления антигенов [18]. Локальное конформационно изменение происходит вдали от активного центра в районах двух различны аминокислотных остатков, к которым прикреплена спин-метка. Обнаружеі низкомолекулярный белок, связывающийся с Fc-областью или Fg-фрагменто» антитела кролика против сывороточного альбумина [38]. При образованш преципитирующего комплекса антитела с антигеном происходят структурны изменения в Сл2-домене Fc-области, наблюдаемые по спектрам ЭПР спин-метки введенной в углеводігую часть С^2 домена, и приводящие к высвобождении

низкомолекулярного белка.

Обращенные мицеллы, хлоропласта. По спектрам ЭПР содержащих нитрокси; цвитгерионов, солюбилизировашгых обращенными мицеллами, установлено сильно* взаимодействие молекул зонда с поверхностью мицелл [39,40,43]. При этом зон, оказывается локализованным главным образом на границе раздела между водной і углеводородными фазами.. Установлено также, что молекулы егшн-меченоп сывороточного альбумина, включенного в кшкроэмульсиошше капли, претерпеваю значительные конформационные изменения. Исследована молекулярная динамик водорастворимого фактора хлоропластов (CF1) при активации фермента [51,63] Обнаружена методом спин-метки сегментальная гибкость молекулі

неактивированного фермента, исчезающая при активации, с последующим увеличением количества SH-rpyrm, доступных для модификации спин-меткой.

Синтетические полимеры и полирибонуклеотиды. Впервые с помощью нового подхода определена сегментальная гибкость спин-меченых синтетических полимеров: поливинилпиридина, поливинилкапролактама и терефталоилхлорида, содержащего спин-меченый 1,10-декандиол [26,27,34,41]. Показано влияние длины боковых групп, несущих радикалы, и жесткости прикрепления их к сегменту полимеров на спектр ЭПР. Изучена динамика олигорибонуклеотидов поли(Ц), поли(А), поли(С) и их комплексов [46,60]. Показано, что сегментальная подвижность полимеров резко ивисит от рН и температуры. Оказалось возможным по форме КШП в спектрах ЭПР эценить соотношение находящихся в динамическом равновесии комплексов голи(ииА) и поли(ААи), состоящих из трех нитей и впервые методом спин-метки токазать образование трешитчатой полинуклеотидной спирали raum(AAU) [60].

Гистоны и ДНК. Исследована динамика поведения молекулы пістона Hj в эастворе отдельно и в комплексе с каталитической субъединицей протеинкиназы из .гозга свиньи [24]. Подтверждено существование гибкости молекулы гистона Н[ и юказано, что комплекс молекулы гистона с каталитической субъединицей также іредставляет собой гибкое образование. При этом в процессе комллексообразования юдвижность спин-метки, присоединенной к остатку тирозина, заметно величивается. Показана возможность наблюдения связывания спин-меченых истонов Н] и Н2Ь с ДНК.

Рибосомы. Исследована температурно-вязкосгаая зависимость метки 5 (Табл.2) [рисоединенной к SH-группам этого огромного белкового образования [61]. )казалось, что метка присоединена к жесткой молекуле огромного молекулярного еса при этом выполняется следствие 3 раздела 2.4, то есть расстояние между КШП в пектрах ЭПР при изменении вязкости среды не измелется [37].

Как было показано в главе 2.1 время корреляции макромолекулы сравнивается с соретическим для соответствующего ей молекулярного веса, как на рис.4. На рис.9 плошной прямой показана стоксовская зависимость времени корреляции акромолекулы от ее объема (или молекулярного веса) и отложены времена орреляции, приведенные к нормальным условиям, для всех макромолекул, сследуемых в данной работе. На рисунке легко различать три случая динамического оведения макромолекулы в растворе в зависимости от эллипсоидальносги, есткости и гибкости ее формы.

7. Примеры изучения динамических и структурних сеойстз спин-меченых глобулярных белкоз в локал&ных конформационпых изменений в них. этой главе первым in спин-меченых объектов исследования рассматривается олекула гемоглобина. Гемоглобин человека - белок с мол.весом 64000, молекула ггорого состоит из 4-х субьедгапщ (две а и две р) [3,37], а молекула гемоглобина

речной миноги [65]из одной субъединицы. Форму тетрамерной молекулы с большой степенью точности можно рассматривать, как сферу, вращательное движение которой строго изотропно и для которой выполняется закон Стокса-Эйнштейна (см.Рис.9). К двум уникальным р93 SH-гругшам молекулы гемоглобина присоединяли различные по структуре спин-метки из Табл.2 (4-6,8-16). Используя все эти метки определялось время вращательной корреляции молекулы гемоглобина по температурно-вязкостным зависимостям ЭПР спектров и методике, изложенной в главе 3. Как и следовало ожидать время х соответствует теоретически рассчитанной величине с учетом сольватации 26 не, все спектры ЭПР различаются по форме линии. Это различие в первую очередь связано с разным типом нитроксила (5-ти или 6-ти членный), с различной структурой спин-метки и с различной стохастической природой динамического взаимодействия нитроксильного фрагмента с ближайшим белковым окружением вблизи спин-метки. Оказалось, что наиболее жестко связанной с молекулой гемоглобина спин-меткой является метка 8 (см.Табл.2) о чей свидетельствуют изотермы при 0 С с величиной 1А =70,5 G близкой к ІА^ =72 G Таким образом, различные структуры спин-меток и нитроксильных раликалої согласно предлагаемой теории никак не влияют на время корреляции (т = 26 не' глобулы белка, но значительно сказываются на эффективной величине параметра S і его функции распределения. На рис. 10,11 показаны спектры ЭПР спин-меченоі (метка 5) молекулы гемоглобина в водном растворе и растворе с сульфатом амммония и соответствующие им теоретические спектры, для которых проведен симуляция по схеме, изложенной в глава 4. На рис.12 схематически показан плотность распределения вероятности параметров S и к по кластерам спин-мечены макромолекул, а на рис.13 графики зависимости частичного усреднения магнитны тензоров радикала от угла а для модели быстрых осцилляции (см.Рис.6). Следуе отметить, что полученные теоретически спектры ЭПР на рис.10,11 отличаются лиш одним параметром т (в полном теоретическом наборе параметров для программы н ЭВМ) равном в первом случае 26 не, а во втором 300 не.

Рассмотрим пример гибкой макромолекулы - спин-меченый (метка 6 в Табл.: IgG [12]. Молекулярный вес равен 150000, а время корреляции, определенное г температурно-вязкостной зависимости, равно 26 не. На Рис.14 показаны зксперимеї тальный и теоретический спектры ЭПР, а на рис.15 зависимость частичнь усреднений магнитных тензоров. На рис.16 показана функция плотное) распределения вероятности по кластерам.

Рассмотрим последний пример [67] также гибкой молекулы - лизоцим из бел куриных яиц, спин-меченый меткой 4 (Табл.2), в спектра:: ЭПР которого, в отлич: от IgG, не содержатся КШП при нормальных условиях. Время вращательні корреляции молекулы белка определяется не мономерной формой макромолекулы, подвижностью гистидин содержащего домена. Согласно молекулярному весу 14,6 к}

М

uo so

>7 SO

» A»50

sso 440

22
A«2

Aiso

A400

Also A>so

Мол.вес/1000

Рис.9 Зависимость экспериментально определяемого времени врашательной

корреляции макромолекул X (не) от их молекулярного веса (Дальтон). 64000 - Гемоглобин, 150000 - Иммуноглобулин G, 50О0О - Fab- фрагмент IgG, 100000 - (Fab')₂ , 850000 - IgM, САБ - 67000, Лизоцим - 14600, Каталитическая субъедишща протеинкиназы с пістоном Нр 62000, гистон Нр 22000, Протеинкиназа - 120000, Аспартатаминотрансфераза - 90000, Каталитическая протеинкиназа - 34000, IgA - 40000. Гликопротеиды мечены спин-меткой по пептидной или углеводной частям.

Рис.10 Спектры ЭПР спин-меченого гемоглобина в растворе при нормальных условиях (спин-метка 4 в Табл.2). Верхний спектр экспериментальный, нижний - теоретический (Параметры симуляции см. на рис.11) Расстояние между крайними точками спектра равно 95,6 G.

Рис.11 Спектры ЭПР спин-меченою гемоглобина (спин-метка 4 в Табл.2) в растворе сульфата аммония. Верхний спектр экспериментальный, нижний - теоретический, который состоит из двух мод: 1) .9=0,7(0,1) и к=-1(0,'05) при а=28; 2)5=0,5(0,2) и к=-1(0,4) при а=42. В скобках указаны дисперсии приведенных величин. Расстояние между крайними точками спектра равно 95,6 G.

A.

-/

В.

Рис.12. А - плотность распределения вероятности существования кластеров для моделированного спектра спин-меченной молекулы НЬ в зависимости от параметров S и к, определяющих положения оси R для каждого кластера (см. рис.10,11); В - то же самое, что и А в координатах углов в, Ф, пересчитанных из величин S и к по формуле (13'), см.рис.6.

ргтш» to G-tMn»oi-» Ualuom

-H p 1 1 1 1 1 к

45' 90 135 180 225 270 315 3S0

pees» to Oult th« Ргоягии 2.0O1O ,

IS

2.0000 ' H 1 1 1 < 1 1 И*

РисІЗ Зависимость частично усредненных компонент А и g тензоров от угла а для основного кластера первой моды спин-меченого гемоглобина при S=0,7hk=-1 (см.рис.11 и формулы (19'),(20'),(21')).

Рис.14 Спектры ЭПР спин-меченого иммуноглобулина G при 20 С (спин-мет

6 в Табл.2). Верхний спектр экспериментальный, нижний -теоретический. Спектр состоит из 4 мод: 1)5==0,6(0,1) и к=1(0,1) с весом 0,3; 2)5==0,6(0,5) и к=-1(0,1) с весом 0,3; 3)5==0,6(0,4) и к=1(0,5) с весом 0,2; 4)5==-0,15(0,6) и к=0,5(0,7) Расстояние между крайними точками спектра равно 95,6 G.

Pr««* to S«« Q-tensor» Value*

_* j ( 1 1 1 I и*

« Э0 135 190 22S 270 Зів 3C0

Pr»9 to Oul* th« Ргмг«п

IS 10

⁰⁰ . '''.'

г-оооо' ^: 1 і 1 1 '—і ^: и ь к»

« 90 І35 . ISO 220 270 ЗІ5 3*0

Рис. 15 Зависимость частично усредненньм компонент А и g тензоров от угла a для первой моды спин-меченого иммуноглобулина G при S=0,6 и к=1 (см.рис.14 и формулы (19'),(20'),(21')).

-о, О

О

в.

+ 1

11»

:ГІУШЖЖ

in an :-10 -«о su (iti ?« її» . «

Рис.16 А -плотность распределения вероятности существования Кластеров для моделированного спектра ЭПР спин-меченной молекулы IgG в зависимости от параметров Skk, определяющих положения оси Я для каждого кластера; В - то же самое, что и А в координатах углов 0, Ф, пересчитанных из величин S и к по формуле (13'), см.рис.6.