Введение к работе
туальиость темы.
Многочисленные исследования показывают, что под действием различных эндогенных и огенных факторов в ДНК и других макромолекулах клетки возникают повреждения, шекулярные защитные системы клетки и репарации ДНК не достаточно обеспечивают юстность генетической информации (Beckman and Ames. 1998). Малые дозы физических и иических агентов, различные эндогенные факторы способны вызывать мутационные и щирогенные нарушения в геноме клеток. Исследования, направленные на выяснение канизмов генетической стабильности, изучение последствий действия физических и «ических факторов на живые организмы и создание средств, методов биомониторинга іяются важнейшими задачами экологической биофизики.
Большую опасность для генофонда всего живого и в том числе человека представляют їиационньїе и химические мутагены, вводимые вереду обитания (Фешбах, Фредли. Экоцид в 'СР, 1992). Повреждения ДНК. если они не будут подвергнуты безошибочной репарации, гут служить причиной мутагенеза, трансформации и гибели клеток, а также развития шичных патологии и увеличения генетического груза в популяциях человека. Формирование тационных изменений в геноме в результате повреждения ДНК, ошибок репарации и пликации и существенное превышение их частоты над фоновым (спонтанным) уровнем может ужить биомаркером для оценки поврежденности орі анизма генотоксинами, эффективности нкционирования системы репарации, риска развития канцерогенеза, старения и других генеративных процессов (Vos , 1995 ). Одним из таких наиболее хорошо изученных и именимых к человеку биомаркеров является мутация по гену гипоксантин-гуанин-юфорибозил трансферазы (ЕС 2.4.2.8., hprt). Этот ген. последовательность которого известна, едставлен в Х-хромосоме единичной копией (Xq26-q27, Paj et al.,1980). Люди, страдающие ндромом Леч-Найхана, имеют дефект по этому гену, и hprt -мутации для клеток іекопнтающих не детальны (Rossiter et al., 1995). В ряде лабораторий ведутся исследования по тагенезу с использованием данного маркера, и особенно на лимфоцитах человека при йствии различных физических и химических агентов. Значительный интерес представляют следования с использованием маркера hprt по изучению эндогенных и экзогенных факторов, щулирующих мутагенез. Как известно, частота спонтанных hprt-мутаций в клетках человека еличивается с возрастом (Albertini et al., 1990). Это увеличение коррелирует с накоплением онтанных повреждений в ДНК (Mullaart eta!.. 1990; Ames et al.. 1993). Вместе с тем не статочно ясно, зависит ли от возраста организма уровень индуцируемых внешними агентами иных мутаций в клетках и, происходит ли снижение эффективности систем защиты клетки с зрастом, недостаточно изучены на молекулярном уровне механизмы закрепления
мутационных изменений в ДНК. Свои исследования мы попытались направить на поиски
ответов, на эти вопросы. Проведение таких исследований важно для понимания не только
механизмов мутагенеза, канцерогенеза и развития, различных возраст - зависимых патолоп
но и для совершенствования методов биомониторинга и оиодозиметрии факторов загрязнеї
среды.
Цель и основные задачи исследования.
Основной целью настоящей работы является изучение частоты спонтанных и индуцироваш
hprt мутаций в лимфоцитах in vivo в зависимости от возраста организма, сравнение
молекулярной природы этих мутаций, а также возможности снижения их уровня диетичесю
антиоксидантами.
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
Определить частоту hprt мутации в лимфоцитах селезёнки мышей разного возраста, необлученных и облученных гамма -радиацией.
Изучить антимутагенное действие диетических антиоксидантов поснижению частоты hpn мутаций в лимфоцитах мышей.
Изучить возникновение hprt мутаций в лимфоцитах человека в результате действия окиси стирола, широко используемого на практике. '
Определить изменение лролиферативной активности hprt" клеток вусловиях in vitro.
Провести сравнительный молекулярный анализ индуцированных и спонтанных hprt мутаь лимфоцитах.
Научная новизна и практическое значение работы.
Проведенные исследования позволили впервые показать существенное увеличение частої
генных мутаций, индуцированных внешним повреждающим агентом (гамма-радиация) в лимфоцитах (in vivo) млекопитающих в зависимости от их возраста. Показано, что скорость пролиферации Т-лимфоцитов с мутациями по гену hprt при культивировании in vitro ниже, і сравнению с таковой у нормальных клеток. Результаты исследований природы мутаций, возникающих в гене hprt спонтанно и под действием окиси стирола, преимущественно представлены заменами оснований (AT>GC. GOTA. АТ<ТА) и делециями (до 200 пар оснований - п.о.). Впервые Показано, что введением в диету мышей дополнительных антиоксидантов удается снизить образование радиационно-индуцированных генных мутаци (по локусу hprt) в лимфоцитах старых и молодых животных. Полученные в работе данные указывают на увеличение чувствительности клеток организма млекопитающих с их возраст мутагенному действию факторов внешней среды. Результаты анализа индуцируемых hprt -мутаций в лимфоцитах селезенки мышей in vivo и снижение их частоты при увеличении антиоксидантов в диете животных указывает на возможность использования этого метода к
ест-системы для скрининга антимутагенов, антиканцерогенов, пригодных для профилактики енетических и канцерогенных последствий действия радиации других факторов среды.
)снопные положення, выносимые на защиту.
С использованием генетического маркера hprt-мутаций в лимфоцитах мышей разного возраста
становлено, что со старением организма увеличивается частота генных мутаций, формируемых іе только спонтанно, но и при действии гамма -радиации, что свидетельствует о возможности
нижения эффективности молекулярных антимутагенных систем клетки с возрастом организма.
Установлено, что длительное дополнительное введение природных антиоксидантов в диету лышам оказывает резко выраженный антимутагенный эффект, выявляемый по снижению іастотьі hprt мутаций в лимфоцитах гамма -облученных мышей разного возраста.
Молекулярный анализ спонтанных и индуцированных окисью стирола hprt мутаций в
іимфоцитах человека показал, что эти мутации формировались в основном в результате замены
эснований (АТ>ГЦ, ГЦ>ТА, АТ>ТА) и делений от 2 до 200 пар оснований. Количественное
:оотношение hprt мутаций, возникающих спонтанно и под действием окиси стирола сравнимо с
;оотношением этих же мутаций, индуцируемых редко ионизирующей радиацией в лимфоцитах
іеловека.
Показано, что скорость пролиферации in vitro лимфоцитов человека с hprt мутацией снижена
то сравнению с таковой нормальных клеток.
\ппобания работы. Материалы диссертации докладывались на семинарах лаборатории
радиационной молекулярной биологии ИТЭБ РАН, на семинарах отдела питания и
токсикологии Каролинского Института Шведской АН, на 2-Радиобиологическом Сьезде (Киев,
1993), на 10-Международном Конгрессе по Радиационным Исследованиям (ICRR) (Вюрцбург,
1995), на практических курсах ЕМВО по сиквенированию DNA (Хейдельберг, 1996), на
международной конференции по мутагенезу (Генуя, 1997), на международной конференции ASI-
NATO (1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 7 статей и ряд тезисов. Объем и структура работы. Диссертационная работа включает в себя введение, обзор
литературы, описание материалов и методов, изложение результатов и их обсуждение, а также
заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 181ссылки. Работа
изложена на 102стр. машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками и 13 таблицами.