Введение к работе
Актуальность работы. Формирование белковых молекул происходит в два этапа: биосинтез соответствующей аминокислотной последовательности и самосборка биологически активной пространственной структуры. Факт спонтанной саморганизации функционально активной белковой структуры делает изучение сворачивания белков одной из важных задач физики белка.
Экспериментальное исследование самоорганизации белка включает в себя два основных подхода: равновесный и кинетический. Равновесный подход заключается в том, чтобы «выключать:» часть молекулярных взаимодействий, поддерживающих нативную структуру белка, и анализировать конформационное состояние, которое при этом реализуется. Такое «выключение:» части внутримолекулярных взаимодействий достигается постепенным изменением внешних условий (состава растворителя, температуры, рН среды и т.д.). Исследователи, используя равновесный подход, обратили внимание, что на пути разворачивания белковых молекул накапливаются конформационные состояния, промежуточные между нативной и полностью развернутой конформацией. Такие состояния получили названия «частично свернутых>.
Было показано, что добавление низкомолекулярных спиртов способно индуцировать образование промежуточных состояний убиквитина, рибонуклеазы А и ряда других белков. Обнаружено, что для лизоцима куриного яйца в трифторэтаноле реализуется частично свернутое состояние, по свойствам аналогичное раннему интермедиату, наблюдаемому при изучении кинетики сворачивания лизоцима.
Кроется ли причина стабилизации промежуточных состояний белков спиртами в свойствах растворителей этого класса, или она заключена в изменении свойств раствора общего характера, например, уменьшении диэлектрической проницаемости среды? Чтобы ответить на вышеуказанный вопрос, необходимо применять растворители другого класса, например сульфоксидов. В данной работе был выбран апротонный растворитель - диметилсульфоксид (DMSO), который в отличие от спиртов не образует сети водородных связей с водой и белком.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состоит в том, чтобы найти условия, где промежуточный интермедиат лизоцима мог бы стабилизироваться, и изучить его различными методами, способными с разных точек зрения охарактеризовать его форму,
размеры, компактность, а также возможную его ассоциацию. При этом решались следующие задачи:
- изучение процесса денатурации лизоцима, индуцированного DMSO;
- подбор условий, где могло бы стабилизироваться частично
свернутое состояние лизоцима;
- подбор методов, способных охарактеризовать частично свернутое
состояние с разных точек зрения.
Научная новизна работы. Показано, что денатурация лизоцима, индуцированная диметилсульфоксидом, приводит к появлению частично свернутой конформации с высокой степенью спиральности, сравнимой с таковой для нативного белка. DMSO стабилизирует спиральные конформации в восстановленном карбоксиметилированном лизоциие, а также в коротких пептидах, полученных путем трипсинолиза лизоцима. Обнаружено, что лизоцик при высоких концентрациях DMSO существует преимущественно в димерной форме.
Практическая значимость работы. Примененные в работе методы дают возможность характеризовать конформацию молекул в составе ассоциатов, что открывает перспективу их более широкого применения в области белковой самоорганизации.
Апробация работы. Материалы исследований представлены на II Международной конференции "Principles of Protein Architecture" (Университет Васеда, Токио, Япония, 1995), на научной конференции Института белка РАН (Пущино, 1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 печатные работы (2 статьи и тезисы) и 1 статья принята в печать. Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя четыре основные части: «введение>, <литературный обзор>, оксперимен-тальная часть>, <результаты и обсуждение:»; завершается выводами и списком литературы. Работа изложена на 103 страницах, включает 4 таблицы и иллюстрирована 28 рисунками, содержит 118 ссылок.