Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор.
1.1. Основные аспекты биологического действия слабых и сверхслабых магнитных полей (МП). 12
1.1.1. Источники МП в окружающей среде. Характеристика и частотно- амплитудные диапазоны МП. 12
1.1.2. Биологические эффекты геомагнитных полей. 15
1.1.3. Биологические эффекты искусственных МП. 23
1.2. Основные аспекты механизмов биологического действия слабых и сверхслабых МП. 50
2 Материалы и методы.
2.1. Исследование действия слабых и сверхслабых магнитных полей на деление планарий Dugesia tigrina. 61
2.2. Исследование действия слабых магнитных полей на мышей с трансплантированными опухолями. 63
2.3. Исследование действия слабых магнитных полей на ДНК- белковые взаимодействия. 70
2.4. Исследование действия слабых и сверхслабых магнитных полей на структуру и функции ряда протеинов. 75
2.4.1. Исследование влияния слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека HIV- 1, выделенную из E.Coli. 75
2.4.2. Исследование влияния слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса саркомы Рауса, выделенную из E.Coli. 78
2.4.3. Исследование влияния слабых и сверхслабых МП на спонтанный гидролиз ряда протеинов. 79
3. Результаты работы и их обсуждение.
3.1. Влияние слабых и сверхслабых магнитных полей на интенсивность бесполого размножения планарий Dugesia tigrina. 81
3.2. Влияние слабых магнитных полей на динамику развития трансплантированных опухолей у мышей. 91
3.2.1. Влияние слабых магнитных полей на динамику развития асцитной формы аденокарциноми Эрлиха. 92
3.2.2. Влияние слабых магнитных полей на динамику развития солидной формы аденокарциноми Эрлиха. 102
3.3. Влияние слабых магнитных полей на ДНК-белковые взаимодействия. 108
3.3.1. Влияние слабых МП на ДНК-белковые взаимодействия в клетках аденокарциномы Эрлиха и клетках головного мозга мышей. 108
3.3.2. Влияние слабых МП на водные растворы ДНК и гистоновых белков. 111
3.4. Влияние слабых и сверхслабых магнитных полей на структуру и функции ряда протеинов. 114
3.4.1. Влияния слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека HIV-1, выделенную из E.Coli. 115
3.4.2. Влияния слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса саркомы Рауса, выделенную из E.Coli. 118
3.4.3. Влияния слабых и сверхслабых МП на спонтанный гидролиз ряда протеинов. 120
Заключение. 139
- Основные аспекты механизмов биологического действия слабых и сверхслабых МП.
- Исследование действия слабых и сверхслабых магнитных полей на структуру и функции ряда протеинов.
- Влияние слабых магнитных полей на динамику развития трансплантированных опухолей у мышей.
- Влияние слабых и сверхслабых магнитных полей на структуру и функции ряда протеинов.
Введение к работе
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
Актуальность темы. Слабые электромагнитные поля (ЭМП) являются экологически значимым фактором внешней среды, влияющим на многие биологические процессы. Живые организмы на планете постоянно находятся под воздействием повсеместно присутствующих естественного геомагнитного и искусственных слабых магнитных полей (МП). Частотно-амплитудный диапазон этих полей широк, велико разнообразие вызываемых ими биологических эффектов.
К настоящему времени в области исследования биологического действия слабых МП накоплен огромный экспериментальный материал, свидетельствующий 'о высокой чувствительности живых систем к их воздействию. Существенный прогресс в понимании процессов, лежащих в основе механизмов биологического действия .слабых МП, а также в принципах формирования биологически активных полей, произошел в середине 80х годов и был связан, прежде всего, с работами А. Либова с соавт.(1985-1996). В этих работах впервые было ясно показано, что эффекты действия слабых комбинированных постоянного и переменного низкочастотного МП наблюдаются преимущественно при определенных, теоретически предсказуемых значениях частот переменной компоненты поля, соответствующих, по крайней мере формально, циклотронным частотам ряда ионов, прежде всего Са2+, К+ и Mg2+. Один из основных эффектов действия слабого поля, зарегистрированный этими авторами, заключался в том, что воздействие низкочастотного (порядка десятков Гц) переменного МП на фоне слабого постоянного поля, сравнимого по величине с геомагнитным полем (десятки мкТл), проявляло себя в изменении концентрации ионов Са2+ во вне- и внутриклеточных средах. Действием этого механизма целый ряд авторов объясняет самые различные эффекты слабых МП в биосистемах: изменение подвижности диатомовых водорослей (B.R. McLeod et al., 1987), изменение условно-рефлекторной
деятельности животных (J.R. Thomas et al., 1986), стимуляцию и подавление различных репарационных процессов (C.F. Blackman et al., 1994; К.А. Jenrow et al., 1995; B.B. Леднев и др., 1996).
Однако экспериментальные результаты, полученные в лабораториях А. Либова и его последователей, и, как следствие, разработанные на их основе теоретические модели, касались в основном действия относительно больших переменных компонент МП (десятки мкТл), в реальных условиях окружающей среды встречающихся крайне редко. Биологические эффекты и механизмы действия слабых геомагнитных (магнитные бури) и техногенных (магнитные помехи высоковольтных линий передач и транспорта) возмущений амплитудой от единиц нТл до мкТл, преимущественно присутствующие в окружающей среде, в теоретических и экспериментальных работах этого направления практически не рассматривались. Помимо этого обстоятельства в вышеуказанных работах в качестве основных мишеней действия слабых полей предполагались неорганические ионы, преимущественно ионы свободного либо связанного с белками Са . Не изучалась возможность настройки полей на «циклотронный резонанс» других биологически активных ионов, в частности органических, в том числе ионных форм молекул ряда аминокислот, заряженных в естественных физиологических условиях. Вследствие этого обстоятельства, до сих пор недостаточно полно были изучены возможные молекулярные мишени и механизмы биологического действия слабых МП.
Таким образом, до сих пор остаются неясными: механизм «циклотронного резонанса»; пороговые величины действия полей; мишени действия (помимо неорганических ионов), которые претерпевают изменения под действием полей определенных частот и амплитуд.
Помимо фундаментального значения решение этих вопросов имеет большое прикладное значение, в особенности для научного обоснования санитарных норм, связанных с проблемой электромагнитной безопасности населения и использования МП в медицине.
Развиваемый нами подход к решению вышеуказанной совокупности проблем (определение пороговых значений МП, частотно-амплитудных диапазонов биологической активности, определение мишеней и молекулярных механизмов биологического действия слабых МП) обозначен в работах, показавших возможность выраженного избирательного действия очень слабых (порядка сотых долей мкТл) переменных компонент МП на фоне более сильного постоянного МП (десятки-мкТл)гобусловленную, прежде всего, кооперативными эффектами -на циклотронных частотах ряда ионов аминокислот в водных растворах, такими как: увеличение ионного тока (В.В. Новиков, 1994, 1996; В.В. Новиков, М.Н. Жадин, 1994; V.V. Novikov, A.V. Karnaukhov, 1997; M.N. Zhadin, et al., 1998), инициация в этих условиях ряда химических реакций -поликонденсации свободных аминокислот (В.В. Новиков, 1994,1998; В.В. Новиков, А.С. Лисицын, 1996,1997) и реакции гидролиза ряда белков и пептидов (В.В. Новиков и др., 1997, Ю.П. Швецов и др., 1998, В.В. Новиков, Е.Е. Фесенко, 2001). Разрабатываемые на основе предлагаемого подхода алгоритмы формирования слабых комбинированных постоянного и переменного МП, позволили обнаружить возможность регулировки ДНК-белковых взаимодействий в биологических и модельных системах, заключающуюся, в частности, в повышении доступности ДНК хроматина к действию ДНКазы 1, за счет снижения, при воздействии слабых МП, функциональной активности различных структурных белков хроматина (гистоновых и негистоновых) - ингибиторов этой ДНКазы (В.В. Новиков и др., 1997; Е.Е. Фесенко и др., 1997). Полученные результаты свидетельствуют о возможности индукции направленных модификаций ключевых молекулярных процессов, в том числе, непосредственно детерминирующих функционирование клеточного генома, при действии слабых МП.
Найденные нами экспериментальные модели и подходы позволили определить пороговые значения величин слабых МП, выявить частотно-амплитудные «окна» их активности, а также исследовать мишени действия
и молекулярные механизмы изменения структуры и функциональной активности этих мишеней на уровнях живого организма и ряда физико-химических систем.
На данный момент имеется совокупность экспериментальных фактов, которые являются сильным аргументом в пользу роли водной фазы в реализации биологических эффектов слабых МП и ЭМП (В.В. Новиков и др. 1999; Е.Е. Фесенко и др., 2000; В.В. Новиков, Е.Е. Фесенко, 2001; Е.Е. Фесенко и.др., 2002; Е.Е. Fesenko, A.Ya. Gluvstein, 1995; Е.Е. Fesenko et al.r 1995 и др.). В этой связи, исследование роли водной фазы в рецепции и развитии ответа организма на действие слабых МП в настоящее время особенно актуально.
Вся выявленная нами совокупность экспериментальных фактов (выраженные биологические эффекты очень слабых МП, передача ряда эффектов через водную среду и др.), обнаруженные чувствительные тест-системы, в частности: деление планарий (В.В. Новиков и-др., 2001) и опухолевый процесс у экспериментальных животных (В.В. Новиков и др., 1996), свидетельствуют о необходимости проведения работ, направленных на детальное изучение биологических эффектов очень слабых МП, сопоставимых по характеристикам с геомагнитным фоном, и исследование механизмов их действия.
Цель работы. Основной целью настоящей работы явилось обнаружение и детальное исследование высокоамплитудных эффектов действия слабых магнитных полей (МП) на биологические и физико-химические системы, определение наиболее активных параметров этих полей, их пороговых значений, частотно-амплитудных диапазонов биологической активности, а также поиск и исследование мишеней действия слабых МП и молекулярных механизмов изменения функциональной активности этих мишеней.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
Провести выбор объектов и моделей исследования, чувствительных к действию слабых МП. В качестве основных моделей были выбраны процесс деления планарий и опухолевый рост у мышей с перевиваемыми опухолями. Основными объектами исследования явились животные: планарий и среда их обитания (водная фаза), а также мыши и их органы (головной мозг, как непролиферирующая или слабо пролиферирующая ткань), активно пролиферирующие клетки животных (клетки карцинома Эрлиха), а также водные растворы хроматина, растворы гистоновых белков хроматина, растворы ДНК, растворы рекомбинантных обратных транскриптаз (ОТ) вирусов саркомы Рауса (RSV) и иммунодефицита человека (HIV-I), растворы ряда других протеинов: ангиотензина 1, А и В цепей инсулина быка, $-амилоидного протеина, апротинина, цитохрома С, карбоангидразы, бычьего сывороточного альбумина и водно-солевые растворы.
Найти параметры слабых комбинированных постоянного и переменного МП, обладающие высокой' биологической активностью. В качестве таковых на основе экспериментальных данных был выбраны параметры, заключающийся в формальном соответствии частот переменной поличастотной компоненты МП условию циклотронного резонанса для ионных форм молекул ряда заряженных в естественных условиях аминокислот, при соотношении величин Впмп/Впемщамп) -1000 и индукции постоянной компоненты МП в диапозоне 20 - 100 мкТл.
В процессе исследований на мышах с трансплантированной опухолью решался ряд промежуточных задач:
а) Провести подбор совокупности адекватных методов и критериев оценки результатов противоопухолевого действия МП. В качестве базовых методов были использованы традиционные методы структурного и ультраструктурного анализа в совокупности с методами
динамического наблюдения за состоянием животных-опухоленосителей и опухолевой тканью.
б) Провести экспериментальный и теоретический анализ и подбор
параметров и режимов воздействия МП для получения выраженного
противоопухолевого эффекта.
в) Провести динамическую оценку структурных и ультраструктурных
реакций опухолевой ткани, в частности реакции клеточного ядра
опухолевых клеток, и окружающих опухоль тканей организма в ответ
на воздействие МП.
4. Развить новый подход к анализу механизмов биологического действия слабых МП, ориентированный на исследование свойств водных растворов различных биологически активных молекул, например, белков и пептидов при воздействии на них очень слабых МП с переменной низкочастотной компонентой порядка десятков нТл и постоянного МП, сравнимого по величине с геомагнитным полем.
Научная новизна. В работе преложен новый алгоритм формирования слабых комбинированных постоянного и переменного МП, заключающийся в формальном соответствии частот переменной поличастотной компоненты МП условию циклотронного резонанса для ионных форм молекул ряда заряженных в естественных условиях аминокислот, при соотношении величин Впмп/Впемщамп) -1000 и индукции постоянной компоненты МП в диапазоне 20 - 100 мкТл. Показано, что воздействие МП, сформированными по этому алгоритму, обладает высокой биологической активностью.
В опытах на планариях Dugesia tigrina получены новые данные, свидетельствующие о чувствительности процесса морфогенеза у планарий к воздействию слабыми и сверхслабыми МП. Показано, что изменение параметров МП или их компенсация позволяет вмешиваться в процесс морфогенеза и изменять его интенсивность. Полученные данные свидетельствуют о возможности эффективного управления рядом биологических процессов с помощью слабых МП с переменной
компонентой порядка десятков нТл. В опытах на этой тест-системе впервые зарегистрированы детальные частотно-амплитудные зависимости величины эффекта от параметров МП в «нанотесловом» диапазоне переменной компоненты поля, а также определины минимальные или близкие к ним пороговые величины биологической активности этой компоненты.
В работе обоснован и проведен выбор параметров МП, посредством которых удается подавить или замедлить развитие экспериментальных опухолей на ранних этапах их развития у лабораторных животных, что показывает наличие собственной противоопухолевой активности у этого физического фактора. Показано, что воздействие МП с определенными параметрами и временными режимами воздействия, вызывает комплекс структурных и ультраструктурных изменений в опухолевой ткани.
Показана возможность регулировки ДНК - белковых взаимодействий с помощью слабых МП в биологических системах и в модельных экспериментах. Полученные результаты свидетельствуют о возможности индукции направленных модификаций ключевых молекулярных процессов, в том числе, непосредственно детерминирующих функционирование клеточного генома, при действии слабых МП' на биологические объекты.
Развит новый подход к анализу механизмов биологического действия слабых МП, ориентированный на исследование свойств водных растворов различных биологически активных молекул (например, белков и пептидов) при воздействии на них очень слабых МП с переменной низкочастотной компонентой порядка десятков нТл и постоянного МП, сравнимого по величине с геомагнитным полем.
Впервые показано, что слабые комбинированные МП существенно ускоряют процессы гидролиза ряда белков и пептидов. Исследованы концентрационная зависимость, динамика процесса, зависимость амплитуды этого эффекта от параметров МП.
На различных тест-объектах (планарии, растворы протеинов) впервые показана передача, по крайней мере, частичная эффектов
действия слабых МП через предварительно обработанную МП водную фазу (водно-солевые растворы), что указывает на важную роль водной среды в механизмах реализации эффектов слабых МП и их рецепции.
Практическая значимость работы. Полученные результаты создают основу для целенаправленного применения МП в медицинской практике. Как показано, подобранные режимы МП, обладают выраженной противоопухолевой активностью, а использованные в работе методы и критерии оценки могут быть адаптированы к условиям клиники.
Данные о снижении активности рекомбинантных ОТ вируса иммунодефицита человека HIV-I и вируса саркомы Рауса при действии на их водные растворы слабых МП, позволяют предположить, что воздействие МП может быть использовано в исследованиях, связанных с репродукцией вируса иммунодефицита человека при ВИЧ инфекции и при других заболеваниях, вызванных ретровирусами, включая и злокачественные новообразования.
Результаты опытов по определению частотно-амплитудных зависимостей и минимальных пороговых величин МП при исследовании ряда выявленных нами высокоамплитудных эффектов МП имеет большое прикладное значение, в особенности для научного обоснования санитарных норм, связанных с проблемой электромагнитной безопасности населения.
Основные аспекты механизмов биологического действия слабых и сверхслабых МП.
В последние десятилетия проблема взаимодействия МП с биологическими системами получила мощный импульс развития. В настоящее время накоплено множество экспериментальных данных, которые показывают, что МП действуют на биологические объекты в очень широком диапазоне амплитуд и частот. Сложная и неоднозначная картина биологических реакций организма на воздействие МП объясняется тем, что вслед за первичным актом прямого воздействия МП на некоторые молекулярные структуры живой ткани следует сложная цепочка вторичных биохимических и физиологических процессов, приводящих к опосредованному отклику, истинную причину которого не всегда удается проследить. В то же время, до сих пор не существует общепринятой идеи о физической природе биологической рецепции ЭМИ столь малых, как геомагнитные флуктуации. Кванты энергии таких полей существенно меньше тепловой энергии движения молекул - «кТ». Этот факт парадоксален с точки зрения физики. Теоретические исследования возможных механизмов биологического усиления не дают однозначного результата в течение длительного времени. Тем не менее, целым рядом исследователей предпринимаются попытки понять этот феномен. Качественный скачок в понимании процессов, лежащих в основе механизмов биологического действия слабых МП, произошел в середине 80-х годов и связан с экспериментальными работами А. Либова (Liboff, 1985а, 1985b) и К. Блекмана с сотрудниками (Blackman et al., 1985а, 1985b). Результаты этих экспериментальных работ позволили предположить существование резонансного механизма, при котором слабое статическое МП, сравнимое по силе с геомагнитным, и меняющееся во времени МП в низкочастотном, теоретически предсказуемом диапазоне частот, соответствующих циклотронным частотам ряда неорганических ионов, прежде всего кальция, калия и магния, могут вызывать значительные биологические эффекты (Liboff et al., 1987; McLeod, Liboff, 1986; Ross, 1990). В результате серии экспериментальных работ, опубликованных в 80-х годах, прежде всего, А. Либовым и др. (Liboff, 1985а, 1992), стало ясно, что непосредственной мишенью воздействия слабых КМП в биосистемах могут быть ионы Са2+, Mg + и К+. Эти авторы впервые использовали КМП с коллинерно направленными постоянной и переменной компонентами поля.
При проведении экспериментов амплитуды измерялись с точностью (±0.1 мкТл), а частота переменной компоненты - с точностью ±0.1 Гц. А. Либов и др. показали эмпирически, что комбинированное поле В = В DC + В АС cos 2nft (1), где BDC и ВАС - величины магнитной индукции постоянной и переменной компонент поля и / - частота переменной компоненты, способно влиять на свойства биосистем при определенных значениях частоты переменной компоненты поля, определяемых формулой: формально соответствующих циклотронным частотам fc вращения иона с зарядом q и массой т в постоянном магнитном поле BDC в вакууме. А. Либов и др. показали, что КМП на частотах циклотронного резонанса оказывают влияние на двигательную активность (подвижность) диатомовых водорослей (McLeod et al., 1987а, 1987b; Smith -et-al., 1987b), вход радиоактивного Ca + в лимфоциты человека (в суспензии) (Liboff et al., 1987; Rozek et al., 1987), всхожесть и прорастание растений из семян (Smith et al., 1993), регенерацию ампутированной головной части в плоских червях Dugesia tigrina (Jenrow et al., 1995, 1996), рост берцовой косточки, выделенной из 7-дневного эмбриона цыпленка (Smith et al., 1991), поведение крыс (Liboff et al., 1989; Thomas et al., 1986), ритмическую активность в срезах мозга крыс (Jenrow et al., 1998) и на ряд других биопроцессов. В результате проведения этих экспериментов были получены экспериментальные данные, подтверждавшие предположение о том, что первичными мишенями воздействия МП на биосистемы действительно могут быть некоторые ионы и, прежде всего Са2+, К+ и Mg +. Однако, при настройке КМП на «резонансные» частоты для Li и Na+, биоэффекты не наблюдались (Smith, 1988; Liboff et al., 1989; Blackman et al., 1995). Сдвиг «биологически активной частоты» при настройке КМП на изотоп 45Са2+ (относительно соответствующей частоты для 40Са2+) в опытах с входом 45Са2+ в лимфоцитах (Liboff et al., 1987; Rozek et al., 1987), также может рассматриваться как серьезный аргумент в пользу роли ионов как первичных мишеней КМП. Важно отметить, что в опытах А. Либова и сотр. по изучению влияния КМП на вход Ca + в лимфоциты и на двигательную активность диатомовых водорослей Маклеодом и др. (McLeod et al., 1987а, 1987b) были впервые получены оценки зависимости величины биоэффектов от частоты переменной компоненты поля («частотные окна»), показана нелинейность в зависимости величины входа 45Са + в лимфоциты от амплитуды переменной компоненты поля («амплитудные окна») (Liboff et al., 1987), а также установлено, что биологическая эффективность 3, 5 и 15 гармоник «циклотронной» частоты (McLeod et al., 1987b; Smith et al., 1995). Наконец, А. Либов и др. (Liboff et al., 1987) показали, что биологические эффекты КМП исчезают при перпендикулярной ориентации ВАС- и BDC компонент, используемой, как известно, в ЯМР- и ЭПР- спектроскопии. Поскольку, по крайней мере, формально выражение (2) соответствует циклотронной частоте данного иона, то феномен возникновения на частоте /с изменений функциональных и метаболических свойств биосистемы,._ был назван ионным циклотронным резонансом (в биосистемах) (Liboff, 1985). Известно, что истинное циклотронное движение одиночных ионов в жидкости не может иметь место не только в слабых, но и в достаточно сильных магнитных полях. Чтобы обойти эту трудность, А. Либов и др. (Liboff, McLeod, 1988; McLeod, Liboff, 1986; McLeod et al., 1987a) предположили, что условия, необходимые для циклотронного движения ионов, имеются в ионных каналах мембран клеток. В частности, согласно А. Либову и др. (Liboff et al., 1988) геликоидальная структура ионных каналов мембран клеток может способствовать движению иона вдоль канала в присутствии КМП. Теоретический анализ, проведенный рядом авторов (Halle, 1988; Durney et al., 1988; Sandweiss, 1990), показал, что гипотеза «циклотронного» резонанса Либова является ошибочной.
Не прибегая к теоретическим выкладкам, можно отметить ее следующие наиболее существенные недостатки: 1. Энергия, которая могла бы быть передана от КМП иону в ионном канале, намного порядков ниже энергии теплового движения иона. Поэтому, уже одно это обстоятельство означает невозможность какого-либо «силового» воздействия магнитного поля на движение иона. 2. Ион, движущийся в канале, окружен цепочками молекул воды. Следовательно, в уравнение (2) для циклотронной частоты должна входить эффективная масса иона с гидратными «хвостами». Это должно приводить к значительному смещению теоретически рассчитанной частоты от ее «циклотронного» значения. 3. Для того чтобы КМП было эффективным, нужно чтобы оно было направлено по оси канала. Однако, очевидно, что в каждый данный момент времени лишь незначительное число ионных каналов в клетке может удовлетворять этому условию. 4. Время прохождения иона через канал очень мало (значительно меньше миллисекунды), т.е. значительно меньше используемых обычно в экспериментах низкочастотной переменной компоненты КМП. Следовательно, резонанс на «циклотронной» частоте не может проявляться. Дополнительные сомнения в биологической эффективности КМП, настроенных на ионный циклотронный резонанс появились в связи с появлением ряда публикаций, в которых сообщалось о невозможности воспроизведения ряда результатов, полученных А. Либовым с сотрудниками. В частности, согласно А. Либову и др. воздействие КМП влияет на вход Са в интактные лимфоциты (Liboff et al., 1987; Rozek et al., 1987). Однако, как было показано рядом групп (см. обзор Walleczek, 1994 и ссылки, приведенные в нем; Prasad et al., 1994), магнитное поле способно воздействовать на лимфоциты только после их активации митогенами, например, конкавалином А, фитогемаглютинином и другими. Результаты Либова и др. относительно влияния КМП в режиме «циклотронного» резонанса на подвижность диатомовых водорослей, всхожесть и рост растений, вход 45Са + в лимфоциты, а также на поведение крыс не удалось воспроизвести или же удалось повторить лишь частично (Reese et al., 1991; Parkinson, Sulik, 1992; Potts et al., 1997; Smith et al, 1993; Prasad et al., 1994; Stern et al., 1996; Davies, 1996; Davies et al., 1998).
Исследование действия слабых и сверхслабых магнитных полей на структуру и функции ряда протеинов.
Все генно-инженерные работы .и манипуляции: выделение плазмидной ДНК, рестрикционный анализ, лигирование фрагментов ДНК, трансформацию клеток E.coli, гель-электрофорез ДНК - осуществляли согласно стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Первичную структуру ДНК определяли по Максаму-Гилберту (Maxam, Gilbert, 1977). На основе векторов клонирования и экспрессии pUC18 и pUC19, содержащих регулируемый Lac-промотор с геном а-цепи Р-галактозидазы Е. coli, была сконструирована рекомбинантная плазмида pRT40 (Мельников и др., 1988). Pol-ген вируса HIV-I выщепляли при помощи рестрикт-аз из плазмиды рВНЮ, кодирующей значительную часть генома вируса иммунодефицита человека HIV-I (Ratner et al.,1985) и встраивали под контроль регуляторных участков транскрипции и инициации трансляции а- пептида (3-галактозидазы. Клонированный ген ОТ отличался от природного по размерам: у pRT40 ген ОТ укорочен с 5 -конца на 3 код она и с З -конца на 147 кодонов. Укорочение генов с 5 -конца происходило за счет расщепления гена ОТ в BglII-сайте. С З -конца ген укорачивали, используя рестриктазу EcoRI (pRT40). Исходя из известных первичных структур Pol-гена и векторов pUC 18 и pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985), была реконструирована ожидаемая структура рекомбинантных ОТ (Мельников и др., 1988) Пришитые у N-конца аминокислотные участки рекомбинантной ОТ происходят от ос-пептида вектора. К ОТ pRT40 к С-концу пришито 49 неприродных аминокислотных остатков, кодируемых районом а- пептида Р-галактозидазы pUC19 со сдвигом рамки считывания. В работе использовались питательные среды для наращивания микроорганизмов фирмы "Difco" (США), для выделения и характеристики фермента ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52 и фосфоцеллюлоза Р-11 фирмы "Whatman" (Германия), гепарин-сефароза фирмы "Phamacia" (Швеция), меченые препараты фирмы "Amersham" (США), поли- и олиго-нуклеотиды фирмы "Boehringer Mannheim" (Австрия), остальные реагенты фирм "Merck", "Sigma", "Serva" (США) и фирмы "Реахим" (Россия). Трансформацию реципиентного штамма E.coli DH-I (F-, racAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17(rk-, mk+), supE44, recA 17Д-) проводили с применением хлористого кальция (Маниатис и др., 1984) ранее полученной плазмидой pRT-40, содержащей под Lac-промотором ген ОТ вируса иммунодефицита человека HIV-I (Мельников и др., 1988). Биомассу E.coli наращивали при 37 С до оптической плотности (при 600 нм) равной 0,5 в колбах, содержащих по 500 мл LB-бульона с рН 7,0 следующего состава: бактотриптон "Difco" 10 г/л, дрожжевой экстракт "Difco" 5 г/л, ампициллин 50 мг/мл, NaCI- 10 г/л, тиамин (витамин В-1) 10 мгк/л, глюкоза - 0,5%, тимин 20 мкг/л.
Биомассу собирали центрифугированием на центрифуге К-80 (ГДР) в течение 30 минут при 3000 об/мин, ресуспендировали в 10 объемах среды для индукции М-9 (Na2HP04 6 г/л, КН2Р04 3 г/л, NaCI 0,5 г/л, NH4CI 1 г/л, MgS04 0,002 мМ/л, СаСІг - 0,001 мМ/л, ампициллин 50 мкг/л, тиамин 10 мкг/л, тимин 10 мкг/л, рН 7,4) и добавляли индуктор ИПТГ (изопропилтиогалактозид) 1 мг/мл. Индукцию проводили в течение 3-4 часов при 37 С. Биомассу вновь собирали центрифугированием с использованием указанного выше режима, замораживали и хранили до использования при -70 С. Для выделения фермента биомассу размораживали и лизировали в буфере (трис-НС1 50 мМ, рН 8,0; сахароза 10%; NaCI 0,3 М; ЭДТА 1мМ; DTT 7 мМ) добавлением лизоцима до 1 мг/мл в течение 10 минут на льду. Затем к лизату добавляли NaCI до 1М, детергент NP-40 до 0,2% и выдерживали на льду еще 10 минут. Лизат центрифугировали на центрифуге J-21 "Beckman"(CIIIA) (ротор JA-10, 18000 об/мин) при температуре 4 С в течение 1 часа. Супернатант диализовали против буфера и проводили очистку хроматографией на колонках с ДЕАЕ-52 целлюлозой, Р-11 фосфоцеллюлозой и гепарин - сефарозой. В процессе очистки рекомбинантной ОТ из лизата E.coli хроматографией на колонках с ДЕАЕ-целлюлозой, фосфоцеллюлозой Р-11 и гепарин-сефарозой ОТ сходит в буфере с ДЕАЕ-52 при 0,15 М NaCI, с Р-11 и с гепарин-сефарозы при 0,3 М NaCI. В результате очистки удалось получить препарат ОТ практически в гомогенном состоянии. РНК - зависимую ДНК полимеразную активность рекомбинантной ОТ тестировали в 20 мкл инкубационной среды (50 мМ трис - HCI, рН 8,0-8,2; 50мМКС1; 10 мМ DTT; 5 мМ MgCI 2; 0,5% NP-40; по 50 мМ dATP, dCTP, dGTP; 0,1 MBq на пробу 3 H-dTTP; 1 мг/мл матрицы поли-гА/олиго-dT) в течение 17 минут при 37 С после добавления 2 мкл исследуемого фермента. Затем инкубационную смесь из пробирки наносили на ДЕАЕ-81 фильтры, которые отмывали от несвязавшейся радиоактивности 0,1 М раствором пирофосфата натрия, водой, этанолом, высушивали и просчитывали радиоактивность в стандартном толуольном сцинтилляторе-на счетчике "Interthecnique" (Франция). Молекулярную массу молекул фермента, обладающих полимеразной активностью определяли с помощью SDS - электрофореза в 8% полиакриламидном геле, содержащем 25 мкг/мл ДНК. После электрофореза гель отмывали от SDS в течение 12 часов с 3-х кратной сменой 50 мМ трис-HCl буфера с рН 8,0-8,2, а затем инкубировали в течение 12 часов при 37 С в растворе, содержащем a-32P-dTTP для определения полимеразной активности. После инкубации гель фиксировали и отмывали от не связавшейся радиоактивности 5% раствором ТХУ и радиоавтографировали с рентгеновской пленкой в течение 12 часов.
Опыты по действию слабых комбинированных магнитных полей на рекомбинантную ОТ вируса иммунодефицита человека HIV-I в водном растворе проведены на экспериментальной установке, детально описанной нами ранее, с такими же параметрами магнитных компонентов поля (Фесенко и др., 1997). Индукция постоянного МП 40 мкТл, амплитуда индукции переменного МП 40 нТл (диапазон частот 3,51-4,65 Гц). Воздействие заданными компонентами МП проводили на раствор фермента (10мкг/мл) в 4мл 0,01М фосфатного буфера при рН 7,0 на установке, описанной выше, в течение 3 часов при 37 С. В качестве базового контроля использовали такой же по составу раствор, инкубируемый в таких же условиях, но вне экспериментальной установки. 2.4.2. Исследование влияния слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса саркомы Рауса, выделенную из E.Coli. Выделение рекомбинантной ОТ из клеток E.coli, трансформированных плазмидой pMF14, очистку до электрофоретически гомогенного состояния, исследование ее полимеразной активности проводили, как описано ранее (Мельников и др., 1988; Chernov et al., 1991; Chernov, Ivanov, 1995). В работе использовались питательные среды для наращивания микроорганизмов фирмы "Difco" (США), для выделения и характеристики фермента ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52 и фосфоцеллюлоза Р-11 фирмы "Whatman"(repMain«i), гепарин-сефароза фирмы "Phamacia" (Швеция), меченые препараты фирмы "Amersham" (США), поли- и олигонуклеотиды фирмы "Boehringer Mannheim" (Австрия), остальные реагенты фирм "Merck", "Sigma", "Serva" (США) и фирмы "Реахим" (Россия). Молекулярный вес фермента определяли с помощью SDS-электрофореза в 8% полиакриламидном геле по Laemmli (Laemmli, 1970). Опыты по действию слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса саркомы Рауса в водном растворе проведены на экспериментальной установке, детально описанной ранее (Фесенко и др., 1997; Швецов и др., 1998). Индукция постоянного МП 40 мкТл, амплитуда индукции переменного МП 40 нТл (диапазон частот 3,51-4,65 Гц). Воздействие заданными компонентами МП проводили на раствор фермента в 100 мкл (30 мкг белка) 0,05 М Трис - HCI буфера при рН 7,5 в течение 3 часов при 37С. В качестве базового контроля использовали такой же по составу раствор фермента, инкубируемый в таких же условиях, но вне экспериментальной установки. РНК - зависимую полимеразную активность рекомбинантной ОТ в растворе, а также молекулярную массу молекул фермента, обладающих полимеразной активностью, определяли по методикам, описанным в разделе 2.4.1. Обработку водных растворов ряда белков и пептидов проводили в химически чистых стерильных полиэтиленовых кюветах объемом 4 мл на установке и по методике, детально описанных нами ранее.
Влияние слабых магнитных полей на динамику развития трансплантированных опухолей у мышей.
Из анализа вышеприведенных данных литературы следует, что слабые МП оказывают в разной степени выраженное ингибирующее действие на развитие различных опухолей. В отдельных случаях при самостоятельном применении ингибирующий эффект сравним с противоопухолевым эффектом высоких доз ионизирующей радиации и сильнодействующих антибластомных цитотоксических препаратов. Однако, следует учесть, что важным преимуществом МП является гораздо более избирательное действие на опухолевые процессы, выражающееся в отсутствии каких-либо признаков повреждения здоровых тканей организма и угнетения функций иммунной и кроветворной систем. Также важно отметить, что степень выраженности ингибирующего и избирательного действия МП на опухолевый рост зависит от удачно подобранных параметров и режимов воздействия. В связи с этим следует отметить, что поиск оптимальных комбинаций частотно-амплитудных характеристик МП и временных режимов воздействия является важным этапом исследования их противоопухолевого действия. К настоящему времени представляются недостаточно исследованными структурные и молекулярные мишени, а также механизмы онкоповреждающего действия слабых МП на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Решение вышеуказанных проблем: разработка оптимальных алгоритмов формирования режимов воздействия слабыми МП, подбор адекватных критериев оценки результатов, определение и исследование структурных, а также молекулярных мишеней опухолевой ткани, в частности, в ядрах опухолевых клеток, позволит, по-видимому, приблизиться к пониманию феномена противоопухолевого действия слабых МП и сформировать основу для целенаправленного применения их в медицинской практике. Первый этап исследований состоял из трех серий опытов. Во всех сериях животным было инокулировано по 1 х 10б клеток АКЭ/мышь. В первой серии опытов проводили поиск частот ПеМП на которых регистрировался бы значимый противоопухолевых эффект при фиксированном значении амплитуды ПеМП - 50 нТл в комбинации с ПМП с величиной индукции 42 мкТл " (в 5-й опытной группе ПМП отсутствовало).
Данная серия опытов включала пять опытных и одну контрольную группы мышей линии SHK по 20 мышей в каждой группе (всего 120 мышей). В серии использовали следующие частоты ПеМП: 3,5-5,0 Гц, 4 Гц, 32,2 Гц, 50 Гц и 3,5-5,0 Гц без ПМП, соответственно нумерации опытных групп. На животных опытных групп оказывали воздействие слабыми комбинированными МП по 2 часа в сутки, начиная с 1-х суток после инокуляции клеток АКЭ по 14-е сутки включительно. Наиболее значимый результат был получен в 1-й опытной группе при использовании суммы частот в диапазоне 3,5-5,0 Гц. У 60% мышей этой группы на все сроки наблюдения, вплоть до трёх месяцев, не было отмечено формирования опухолевого асцита и не зарегистрирована гибель животных (рис. 7). В значительно меньшей степени зарегистрированы противоопухолевые эффекты во 2-й (4 Гц) и 3-й (32,2 Гц) опытных группах, проявившиеся в незначительном удлинении сроков жизни животных-опухоленосителей (рис. 7). Не отмечено разницы по сравнению с контрольной группой в 4-й (50 Гц) и 5-й (3,5-5,0 Гц без ПМП) опытных группах (рис. 7). Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что выраженным противоопухолевым эффектом обладает слабое низкочастотное МП, в котором воздействующий сигнал представлял сумму гармоник частот в диапазоне 3,5-5,0 Гц, в комбинации со слабым ПМП. Более эффективным оказался многократный режим воздействия слабыми МП с такой с двух часовой продолжительностью одного цикла воздействия (рис. 9). Цитологическое исследование отпечатков показало практически полное отсутствие опухолевых клеток в перитонеальной полости животных, у которых отмечается отсутствие формирования опухолевого асцита. По сравнению с клеточным составом отпечатков из перитонеальной полости интактных животных, у животных этой группы отмечен выраженный полиморфизм клеток мезотелия и некоторое увеличение количества нейтрофилов, а также присутствие значительного количества дегенеративных клеточных форм. Позже (к 20-м суткам) клеточный состав пер итонеальнои жидкости нормализуется и практически не отличается от такового интактных животных. При удлинении интервала между временем инокуляции и началом воздействия МП выживаемость животных-опухоленосителей значительно уменьшилась и составила 30%. Так, при начале циклов воздействия с 6-х суток после инокуляции уже через сутки после начала цикла воздействий МП у части отмечены (50%) признаки регрессии сформировавшегося опухолевого асцита, проявившиеся в уменьшении объёма асцитической жидкости, количество которого к 5-7 суткам после начала воздействий возвратилось к нормальным значениям, характерным для интактных животных. Гибель части мышей (20%) зарегистрирована на 11-14 сутки при регрессии опухолевого асцита с признаками интоксикации. Выжившие животные оставались жизнеспособными до окончания сроков наблюдения, свыше трёх месяцев. Особо следует отметить, что в этой группе удалось идентифицировать комплекс деструктивных изменений в опухолевых клетках в виде разрушения ядерного материала по типам кариорексиса и кариолизиса (рис. 11) и реакцию со стороны клеток крови, проявившуюся в значительном увеличении количества лимфоцитов и моноцитов в асцитической жидкости на определённые сроки наблюдения (10-14 сутки). Для сравнения, на рисунке 10 показаны опухолевые клетки АКЭ контрольного животного. На более поздние сроки цитологического наблюдения (к 40-м суткам) клеточный состав отпечатков из брюшной полости выживших животных этой группы не отличается от аналогичных препаратов интактных животных.
Важное значение имеет продолжительность одного сеанса воздействия МП, так при уменьшении продолжительности с двух часов до 30 минут, при таком же многократном варианте воздействия, как в предыдущих группах, значительно снизилась эффективность противоопухолевого действия слабого МП (рис. 9). Увеличение продолжительности воздействия МП с двух до шести часов, с ранних сроков после инокуляции опухолевых клеток не привнесло существенных различий между результатами в этих группах (рис. 9). Выжившие животные оставались жизнеспособными до окончания сроков наблюдения, свыше трёх месяцев. На основании выше приведённых данных можно заключить, что наиболее выраженной и сбалансированной противоопухолевой активностью обладает многократный режим воздействия МП с двух часовой продолжительностью одного сеанса, с ранних сроков после инокуляции опухолевых клеток. Основным следствием совокупности работ, выполненных на первом этапе исследований, явился подбор оптимальных или близких к оптимальным параметров и временных режимов воздействия МП, вызывающего выраженный и воспроизводимый противоопухолевый эффект. Экспериментально нами определена частотно-амплитудные значения переменной компоненты поля (3,5-5,0 Гц - частоты, соответствуют формально циклотронным частотам ионным форм молекул ряда аминокислот; 50 нТл - амплитуда соответствует диапазону флуктуации слабо возмущённого ГМП), и, таким образом, показана целесообразность использования поличастотного сигнала, обладающего большей биологической активностью по сравнению с моночастотным синусоидальным полем. Также показана необходимость воздействия ПеМП, именно, в комбинации с ПМП с величиной близкой к ГМП. По результатам экспериментальных исследований определена оптимальная продолжительность одного сеанса воздействия (2 часа), и показана эффективность многократного циклического воздействия. Экспериментально установлена зависимость выраженности противоопухолевой активности МП от параметров экспериментальной модели: обнаружена большая эффективность воздействия МП на ранних сроках развития опухоли (с 1-х суток после инокуляции). Важно отметить, что работы на этом этапе были проведены на мышах различных линий, и хорошая воспроизводимость результатов опытов свидетельствует о том, что МП являются, по-видимому, одним из универсальных противоопухолевых факторов.
Влияние слабых и сверхслабых магнитных полей на структуру и функции ряда протеинов.
Далее, естественным следствием предыдущей работы явилась оценка ферментативной активности различных классов ферментов нуклеинового обмена в модельных системах, состоящих из водных растворов обратных транскриптаз и ряда других ферментов. Для этого были использованы различные варианты метода радиоизотопного анализа, включая также метод радиоавтографии, с использованием в качестве маркеров меченных радиоактивным фосфором нуклеотидов. В процессе исследований, направленных на решение данной задачи, был так же решен ряд промежуточных подзадач, а, именно, были выделены из ранее сконструированных штаммов-продуцентов E.coli, трансформированных соответствующими плазмидами, рекомбинантные обратные транскриптазы вируса саркомы Рауса и вируса иммунодефицита человека HIV-1 (Швецов и др. 1991). Обозначенные исследования позволили идентифицировать молекулярные мишени, наиболее чувствительные к действию слабых МП, из числа ферментов нуклеинового обмена. Следующей задачей данной исследовательской программы является детальное изучение молекулярных механизмов, посредством которых реализуется регуляция ДНК - белковых взаимодействий при действии слабых МП. С учетом предварительно полученных нами данных, можно предположить, что в основе выше обозначенных эффектов регуляции ДНК - белковых взаимодействий лежат в первую очередь механизмы структурно-функциональных модификаций белковых и пептидных молекул при действии слабых МП. Это, возможно, обнаруженные нами ранее конформационные перестройки белковых макромолекул в водных растворах (Новиков и др., 1999). В результате реализации дальнейшей работы были определены степени и особенности конформационных изменений белков рядом общепринятых методов оценки, включая методы флуоресцентной спектроскопии (Новиков и др., 1999, Новиков и др., 2000). Также были исследованы процессы спонтанного и индуцированного гидролиза белковых и пептидных молекул стандартными методами химии белка, такими как: HPLC, аминокислотный анализ, секвенс и др. Нам представилось заманчивым определить особенности гидролиза белков в присутствии слабых МП, прежде всего, такие как скорость гидролиза и локализация сайтов молекул, наиболее чувствительных к действию поля.
Эта задача была тем более интересна потому, что в работах нами была показана возможность существенного ускорения гидролиза ряда структурных белков хроматина (гистоновых и негистоновых), ряда ферментов нуклеинового обмена (в том числе, рекомбинантной обратной транскриптазы вируса саркомы Рауса), а также целого ряда пептидных и белковых молекул (ангиотензин 1, А и Б цепи инсулина, (3 - амилоидный протеин, апротинин, цитохром С, карбоангидраза) при действии слабых коллинеарных постоянного и низкочастотного переменного МП, формально настроенных на циклотронный резонанс ионных форм молекул ряда аминокислот (Новиков и др., 1997; Швецов и др., 1998; Новиков, Фесенко, 2001). Исследование этих процессов, помимо принципиально важной информации о ключевых механизмах биологического действия слабых МП на функционирование клеточного генома, позволит также получить дополнительные сведения о частотно - амплитудной и других зависимостях эффектов действия слабых МП. 3.4.1. Влияния слабых МП на рекомбинантную обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека HIV-1, выделенную из E.Coli. Целью настоящей части работы являлось исследование изменения ДНК-полимеразной активности рекомбинантной обратной транскриптазы вируса HIV-I, выделенной из E.coli, при действии in vitro слабых комбинированных постоянного и низкочастотного переменного магнитных полей. На рис. 24 и 25 представлены результаты, показывающие изменение ДНК-полимеразной активности исследуемого препарата рекомбинантной ОТ при действии на его водный раствор слабых комбинированных магнитных полей. Как видно из представленных результатов, ДНК-полимеразная активность рекомбинантной обратной транскриптазы HIV-I значительно снижается при действии на ее водные растворы слабых комбинированных магнитных полей, вероятно, за счет структурных модификаций молекулы рекомбинантного фермента. Это позволяет предположить, что воздействие комбинированными магнитными полями может быть использовано в исследованиях связанных, с репродукцией вируса иммунодефицита человека при ВИЧ инфекции. На рис. 26 и 27 представлены результаты, показывающие изменение РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности рекомбинантной обратной транскриптазы вируса саркомы Рауса, выделенной из Е.соїі, в контрольном опыте и при действии слабого комбинированного магнитного поля. Как видно из представленных результатов, РНК-зависимая ДНК-полимеразная активность фермента в контрольном опыте снижается незначительно, вероятно, за счет специфического протеолиза, при котором Р-субъединица с молекулярной массой 90000 дальтон распадается на ос-субъединицу с молекулярной массой 60000 дальтон, обладающей меньшей полимеразной активностью чем Р-субъединица, и на фрагмент с молекулярной массой 30000 дальтон, не обладающий полимеразной активностью. На рис. 26 представлены результаты исследования полимеразной активности контрольных и опытных препаратов фермента с помощью SDS-электрофореза с последующей радиоавтографией. Как видно из представленных результатов полимеразной активностью обладают бета-субъединица и образующаяся из нее, вероятно, в результате специфического протеолиза, альфа-субъединица контрольных препаратов фермента. Препарат ермента после воздействия слабых комбинированных магнитных полей значительной степени утрачивает свою полимеразной активность.
Представленные в этих модельных экспериментах данные могут иметь интерес для дальнейших исследований действия МП на ОТ и другие белки в цикле развития ретро вирусов. , с учетом вышеприведенных данных, был реализован подход к анализу механизмов биологического действия слабых МП, ориентированный на исследование свойств водных растворов ионных форм молекул ряда аминокислот, а также органических биополимеров аминокислот - белков при воздействии очень слабых МП с переменной компонентой порядка десятков нТл и постоянного МП, сравнимого по величине с геомагнитным полем, в условиях, соответствующих «циклотронному резонансу» для ионных форм молекул ряда аминокислот. Было показано, что воздействие МП в этих условиях приводит к существенному снижению устойчивости ДНК хроматина к ДНКазе 1. В значительной степени этот эффект обусловлен снижением функциональной активности ряда ядерных белков - ингибиторов ДНКазы 1, которое может быть сопряжено со структурными повреждениями этих белков. При анализе причин такого снижения были отмечены существенное ускорение процессов ограниченного гидролиза исследуемых белков (Новиков, Фесенко, 2001), а также изменение ряда параметров флуоресценции белков (Новиков и др., 1999), которое было интерпретировано нами как следствие изменения микроокружения белков в водной среде при действии слабых МП, обусловленное структурными перестройками водной фазы. Ясно, что эффект ускорения спонтанного гидролиза белков при действии слабых МП является принципиально важным в оценке их биологической активности, а также может оказаться существенным для исследований структуры белков. Исследование особенностей и закономерностей этого процесса проведено нами в данной работе на хорошо изученных коротких пептидах (ангиотензин 1, А и Б цепи инсулина быка и др.), а также на ряде более длинных полимеров аминокислот. При высокоэффективной жидкостной хроматографии исходных образцов синтетического пептида - ангиотензина 1 (30 мкг/мл), регистрируется один индивидуальный пик на 23 минуте элюции (рис. 28а), соответствующий выходу этого пептида в 39% ацетонитрила. На хроматограммах контрольных образцов пептида, экспонирующегося в водном растворе при комнатной температуре в течение 12 часов, отмечено появление двух минорных пиков (рис. 286), предшествующих по времени выхода с колонки исходной молекуле.
