Содержание к диссертации
Введение
1. Использование микроорганизмов в экотоксикологическои оценке качества почв (обзор литературы) 10
1.1. Использование природных микробных популяций в оценке качества почв 10
1.2. Использование изолированных культур микробных тест-объектов в оценке качества почв 21
2. Материал и методы 32
2.1. Материал 32
2.2. Методы 36
2.2.1. Методы сбора и первичной обработки материала 36
2.2.2. Методы лабораторных работ 37
2.2.3. Методы анализа результатов исследования 38
3. Оценка состояния почвы селитебных территорий по изменению интенсивности микробной люминесценции 40
3.1. Определение суммарной токсичности почвенных проб по изменению интенсивности микробной люминесценции 40
3.2. Модельные опыты по изучению влияния ряда солей тяжелых металлов на биосенсор «Эколюм» 57
3.3. Сравнительный анализ данных микробиоиндикационных (на примере биосенсора «Эколюм»), химико-аналитических и фитобиоиндикационных методов оценки качества почвы селитебных территорий 63
4. Оценка состояния почвы селитебных территорий по эффекту бактерицидного воздействия на бактерии Bacillus subtilis 85
4.1. Методика оценки суммарной токсичности образцов почвы с использованием тест-объекта бактерий Bacillus subtilis 86
4.2. Определение суммарной токсичности почвенных проб (по тест-реакции Bacillus subtilis) 90
4.3. Сравнительный анализ данных микробиоиндикационных (по тест-реакции Bacillus subtilis), химико-аналитических фитобиоиндикационных методов оценки качества почвы селитебных территорий 93
5. Сравнительный анализ возможностей использования бактерий биосенсора «Эколюм» и бактерий Bacillus subtilis как тест-объектов в биоиндикационной оценке качества почв 104
6. Использование средств ГИС при оформлении результатов микробиоиндикационной оценки почв селитебных территорий 107
Выводы 113
Литература 115
Приложение 1
Приложение 2
Приложение 3
Приложение 4
Приложение 5
Приложение 6
- Использование природных микробных популяций в оценке качества почв
- Модельные опыты по изучению влияния ряда солей тяжелых металлов на биосенсор «Эколюм»
- Методика оценки суммарной токсичности образцов почвы с использованием тест-объекта бактерий Bacillus subtilis
- Сравнительный анализ данных микробиоиндикационных (по тест-реакции Bacillus subtilis), химико-аналитических фитобиоиндикационных методов оценки качества почвы селитебных территорий
Введение к работе
Актуальность темы. Почва, как природное образование, выполняет ряд глобальных функций, имеющих непосредственное экологическое значение; она также выступает как среда обитания живых организмов, включая человека; по отношению к человеку почва является незаменимым природным ресурсом, главным средством сельскохозяйственного производства и местом поселения людей (Докучаев, 1961; Одум, 1975; Розанов, Розанов, 1994).
Под влиянием хозяйственной деятельности человека, почва претерпевает целый спектр изменений негативного характера, что приводит к утрате ряда функщтональных характеристик и ее деградаціпі (Гришина и др., 1994; Кузнецов, 1999;Мотузова, 1994).
Высокий уровень техногенной нагрузки на почву особенно характерен для урбанизированных территорий. В настоящее время в городах, других населенных пунктах и их окрестностях почва существенно отличается от почвы естественных экосистем, играющих важную роль в поддержашш экологического равновесия. В результате постоянно возрастающих антропогенных нагрузок, интенсивность естественных процессов самоочищения почвы снижается. Это, в свою очередь, может привести к миграции накопленных в ней токсикантов в пищевые цепи, воздушные слои, водоносные горизонты, создать условия для активизации в почве патогенных, опасных в эпидемическом отношении микроорганизмов, т.е., создать прямую или косвенную угрозу здоровью и безопасности населения (Ерусалимская и др., 1993; Калачникова и др., 1987; Калашникова, 1999).
Таким образом, возросший антропогешшй прессинг стимулирует разработку новых и модификацию уже существующих способов оценки качества почв как одного из компонентов окружающей среды. Современная
система контроля состояния компонентов окружающей среды, основанная на химико-аналитическом определении отдельных поллютантов и соответствии их ГОСТам и ПДК, далеко не охватывает весь спектр токсических поллютантов, общее число которых, по данным Международного регистра, уже превысило 50000 (Пшеничное, Закиров, Никитина, 1995).
Кроме того, что некоторые рекомендуемые анализы сложны,
дорогостоящи, они неэффективны в оценке синергетного действия факторов
различной природы (Майстренко, Хамитов, Будников, 1996).
Возможным выходом из этой ситуации может быть применение биотестирования как способа определения эффекта суммарного воздействия поллютантов.
Анализ ответной реакции живых организмов - биотестов - на действие факторов среды позволяет получить интегральную оценку качества среды: выявить не отдельные вредные вещества, а общебиологический эффект их влияния с учетом взаимоусиления іши ослабления (Бурдин, 1985; Вайнерт и др., 1988; Захаров, Кларк, 1993; Пшеничнов, Закиров, Никитина, 1995). Кроме того, оценка территорий методами биоиндикации является экспрессной и недорогостоящей, а потому может использоваться как рекогносцировочная для выявления и локализации тех зон, где необходимо более точное, детальное исследование классическими методами анализа.
Оценка качества почв при помощи высших организмов разработана достаточно успешно (Жуков, Пилипенко, Киреева, 1997; Сметана, Мазур, Красова, 1997; Aksoy, Hale, Dixon, 1999; Debus, Niemann, 1998; Hammel, Steubing, Debus, 1998; Gichner, Veleminsky, 1999; Kohler et al., 1992; van-Schooten, 1995; Stiirzenbaum, Kille, Morgan, 1998 и др.). Однако, при определении допустимой меры антропогенного воздействия на экосистемы, представляется необходимым учитывать реакцию не только высших, но и низших организмов, специфические особенности которых могут дать целый ряд преимуществ, по сравнению с высшими организмами, при использовании их с целью биоиндикации состояния почвенной среды (Ильин, 1982; Никитина, 1991; Циприян, Коршун, Дацюк, 1993; Reormpagel, Janssen,AMf,1998).
В этой связи, закономерный интерес вызывают микробные популяции. Благодаря малым размерам, микроорганизмы имеют большую относительную поверхность контакта со средой обитания. Ответные реакции микроорганизмов на внешние воздействия наступают быстро, они весьма чувствительны и касаются различных сторон жизнедеятельности - роста, накопления хігмических элементов, активности звеньев метаболических процессов, состояния регуляторных процессов. Высокие скорости роста и размножения микроорганизмов дают возможность в короткий срок проследить за действием любого экологического фактора на протяжешга
десятков и даже сотен поколений (Гузсв и др., 1995).
Существует ряд причин, затрудняющих использование бактериальных биодатчиков в биоиндикационной оценке качества почв. Среди них: длительность и сложность культивирования биообъекта, сложность регистрации ингибирующего действия конкретного ксенобиотика, громоздкость методов и использование стационарной (лабораторной) аппаратуры для регистрации ингибирующих эффектов (Смирнов, Кузнецов, Голубев, 1995).
В результате, оценка качества почвенной среды путем использования микробных тест-объектов пока не нашла широкого применения в экологическом мониторинге, несмотря на ряд ее преимуществ.
В связи с этим, актуальными являются исследования, направленные на выявление таких микробных тест-объектов, которые могут быть использованы при экологической оценке состояния почвы без особых затруднений в их культивировании и интерпретации полученных данных, характеризующих их ответную реакцию на загрязнения.
Цель и основные задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось изучение возможностей оценки состояния почвы некоторых селитебных территорий с использованием биосенсора «Эколтом» и бактерий Bacillus subtilis в качестве тест-объектов.
В связи с поставленной целью решались следующие задачи:
-
Детально изучить возможности использования микробного биосенсора «Эколюм» в мшфобиоиндикационной оценке качества почв.
-
Провести обследование методами микробиологической индикации урбанизированных и естественных почв следующих территорий:
санитарно-защитной зоны (СЗЗ) полигона по захоронению твердых
бытовых отходов (ТБО), г. Калуга;
наиболее подверженной загрязнению атмосферного воздуха
автотранспотрной магистрали г. Калуги - ул. Московской;
прибрежных зон пригородных рек Терепец и Ячейка в качестве
пойменных территорий, подверженных интенсивному
техногеїшому воздействию;
прибрежной зоны реки Шаня в качестве пойменной территории,
слабо подверженной техногенному воздействию;
Калужского городского бора, в качестве рекреационной зоны, слабо
подверженной техногенному воздействию.
-
Провести сравнительный анализ результатов оценки состояния почв, полученных с использованием микробиоиндикационньгх (на примере микробного биосенсора «Эколюм»), фитобиоиндикационных и химико-аналитических методов оценки качества почв и обосновать приоритетность биоиндикационного микробиологического подхода.
-
Исследовать возможности использования бактерий Bacillus subtilis в качестве тест-объекта при проведении биоиндикационной оценки качества почвенной среды в селитебной зоне.
-
Провести сравнительный анализ методов оценки качества почв с использованием микробного биосенсора «Эколюм» и бактерий Bacillus subtilis в качестве тест-объектов.
-
Провести анализ полученных в исследовании данных с использованием ГИС-технологий и изучить возможность их последующей реализации в муниципальной экологической ГИС.
Научная новизна работы.
Впервые были определены условия интерпретации результатов пространственного анализа селитебных территорий с использованием люминесцентных бактерий биосенсора «Эколюм».
Впервые проведен сравнительный анализ мшфобиоиндикационных (на примере биосенсора «Эколюм»), фитобиоиндикационных и химико-аналитических методов определения качества почв. Обоснована приоритетность применения биосенсора «Эколюм» при проведении биоиндикационной оценки качества почв согласно задачам Государственного комитета по экологии.
Впервые разработана методика определения качества почвенных сред при помощи бактерий Bacillus subtilis в качестве тест-объекта.
Впервые в интерпретации результатов микробиоиндикационной оценки качеств почв селитебных территорий были использованы ГИС-технологии.
Основные положения, выносимые па защиту. На защиту выносятся:
авторская интерпретация результатов использования биосенсора «Эколюм» для микробиоиндикационной оценки качества почвы селитебных территорий; результаты сравнительного анализа данных о состоянии почв, полученных с использованием микробиоиндикационных (на
примере микробного биосенсора «Эколюм»),
фитобиоиндикационных и химико-аналитических методов
оценки качества почв;
методика и результаты исследования состояния почвы с
использованием в качестве тест-объекта бактерий Bacillus
subtilis;
сравнительный анализ результатов применения биосенсора
«Эколюм» и Bacillus subtilis в микробиоиндикационной оценке
почвы;
предложения по применению ГИС-технологий для анализа
данных микробиоиндикации. Практическая значимость работы. Проведенный детальный анализ возможностей использования микробного биосенсора «Эколюм» в биоиндикационной оценке качества почв, позволил выявить некоторые ограничения в его применении, касающиеся интерпретации данных территориальной оценки состояния почвы, внес ряд корректив в стандартную методику.
Разработанная методика оценки состояния почв с помощью бактериального тест-объекта Bacillus subtilis может быть рекомендована в комплексе с использованием биосенсора «Эколюм», при проведении почвенного мониторинга селитебных территорий.
Полученные результаты отвечают требованиям ГНС-технологий и могут быть использованы в муниципальных экологических ГИС, а также для ведения экологического мониторинга.
Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на научных семинарах кафедры ботаники и экологии КГПУ (1996 - 98 гг.), научной конференции, посвященной 50-летию КГПУ (Калуга, 1998); Международном научном совещании «Жизнь и факторы биогенеза» (естественнонаучные аспекты) (Ижевск, 1999); V Всероссийской научно-практической конференции «Образование и здоровье» (Калуга, 1999); Всероссийской научной конференции «Экологические и метеорологические проблемы больших городов и промышленных зон» (Санкт-Петербург, 1999), межрегиональной научной конференции «Вопросы археологии, истории, культуры и природы верхнего Поочья» (Калуга, 1999).
Публикация результатов. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы и 6 приложеніш. Общий объем работы составляет 134 страниц, включая 46 рисунков, 6 таблиц. Список литературы включает 148 наименований, из них 52 - на иностранных языках.
Использование природных микробных популяций в оценке качества почв
Использование природных микробных популяций в оценке качества почв, отслеживание параметров их жизнедеятельности является классическим, широко применяемым методическим подходом; по этой причине, большая часть специальных научных публикаций посвящена практической реализации именно этого методологического принципа.
С целью оценки степени влияния различных загрязняющих веществ, при оценке качества почвы используется слежение за изменением состава и структуры микробных сообществ почвы, как для отдельных таксономических, так и для отдельных трофических групп почвенных микроорганизмов (Васильевская, 1994).
При этом исследователи используют различные параметры жизнедеятельности микробных популяций (Горленко и др., 1996; Roane, Kellogg, 1996), и один из наиболее распространенных - ростовые характеристики; к нему также могут быть причислены динамические характеристики микробных популяций (Павлюкова, Гришко, 1988) и соотношение отдельных таксономических и физиологических групп.
Так, Клевенская И. Л. (1985) показывает, что при попадании в почву таких токсичных поллютантов, как тяжелые металлы, снижается общая биомасса микроорганизмов, а также численность отдельных физиологических и таксономических групп. При этом наибольшей чувствительностью обладают актино-мицеты, некоторые аммонификаторы, азотобактер и дрожжи рода Lipomyces. Наиболее же устойчивы к воздействию больших концентраций тяжелых металлов микроскопические грибы, в частности представители родов Mucor и Trichoderma.
Косинова Л. Ю. (1985) также отмечает высокую чувствительностью к загрязнением тяжелыми металлами актиномицетов: динамика их численности, по ее мнению, также может применяться при оценке качества почв.
Булавко Г.И (1989) в модельных опытах, имитирующих загрязнение дерново-подзолистой почвы и чернозема, выщелоченного свинцом, наблюдал изменение величины и состава комплекса почвенных микроорганизмов. При не значительном изменении биомассы микроорганизмов в составе комплекса возрастала доля грибов и снижалась численность актиномицетов и бактерий.
Марфенина О.Е. (1987; 1989), Kowalski S. (1996) рассматривают биомассу и видовой состав микроскопических грибов в качестве адекватного показателя при экологическом мониторинге состояния почв.
Ивашина С. А. (1989) исследовала экологические и санитарно-гигиенеические показатели, характеризующие структуру микробиоценоза, санитарное состояние почвы и ее способность к самоочищению при внесении ме-илнитрофоса, рид омила, фурадана, зенкора и ленацила в дозах от 0,1 до 10 мг/кг.
Наиболее чувствительными показателями, изменяющимися при внесении большинства исследуемых препаратов, были численность микромицетов, кишечной палочки, бактерий на МПА. Качественный состав микроорганизмов под действием препаратов, как правило, не изменялся.
Толкачев Н. 3. (1976) приводит данные о том, что такие гербицидные фе-нилмочевины, как монурон и диурон не вызывают существенных изменений численности почвенной микрофлоры, а под влиянием фенурона и метурина общая численность микрофлоры увеличивается и возрастает относительное содержание грибов Fusarium spp. и Penicillium spp.
По данным Лугаускаса А. Ю., Шляужене Д. Ю., Репечкене Ю. П. (1981), с повышением содержания свинца в почвах заметно увеличиваются сукцесси-онные процессы видового состава грибов в сообществе. Менее чувствительными к содержанию свинца в почве оказались: Cladosporium herbarum, Sclerotinia trifoliorum, Fusarium culmorum, Mucor circinelloides, Corethropsis hominis, Penicillium brevi-compactum, P. lilacinum, P. expansum.
Наплевкова H. H., Булавко Г. И. (1985) свидетельствуют о возможности использования в качестве индикатора присутствия свинца в почве показателя увеличения относительной доли в бациллярном компоненте микрофлоры еледующих спорообразующих бактерий: Bacillus mycoides, Вас. cereus, Вас. mesentericus, Вас. agglomerates.
Динамика численности популяций Penicillium lilacinum может быть выбрана индикаторной характеристикой загрязнения почвы кадмием. С другой стороны, этот же вид микроорганизма, как и Penicillium expansum и Penicillium brevi-compactum не могут служить индикаторами присутствия в почве повышенных концентраций свинца: эти представители микробиоты достаточно устойчивы к нему.
Самсонова А. С. (1995) предлагает определять техногенное воздействие на почву, отслеживая численность нитрифицирующих бактерий, видовое разнообразие микроорганизмов в зоне предполагаемого антропогенного влияния, активность процессов минерализации, которая может быть определена по динамике численности актиномицетов. Автор также указывает на техногенно обусловленную активацию микромицет и спорообразующих бактерий, среди которых преобладают Bacillus virgilus, Вас. brevis, Вас. subtilis.
Эпифитная микрофлора растений техногенных территорий также характеризуется снижением общего числа микроорганизмов, обеднением их качественного состава; уменьшением количества молочнокислых бактерий, увеличением в микробном сообществе удельного веса спорообразующих бактерий и микроскопических грибов. Ксенобиотики могут нарушать также развитие ризо-сферной микрофлоры.
McVicker L., Duffy D., Stout V. (1998) сообщают об использовании ростовых характеристик микробных популяций для анализа почв, загрязненных эти-ленгликолем.
Ohya Н et al. (1988) определяли угнетающее воздействие сочетанного действия свинца и цинка в почве по уменьшению числа бактерий и колоний грибов по сравнению с контролем.
Васильченко В. Ф., Малецкая О. С, Акименко Л. И (1981) изучали влияние на почвенную микрофлору тордона 22-К и банвела-Д. В диапазоне концентраций 10-1000 мкг/г почвы было выявлено резко выраженное активирующее действие упомянутых гербицидов на развитие аэробных сапрофитных бактерий, микроскопических грибов. Доминировали грибы рода Fusarium.
Никитина 3. И. (1991) приводит данные об увеличении содержания грибного компонента в почве техногенно нарушенных экосистем. Подобное явление отмечается многими исследователями и, вероятно, объясняется большей толерантностью микроскопических грибов к разным геохимическим элементам (Марфенина, 1987).
По данным Стефурак В. П (1981), чувствительным показателем оценки действия таких поллютантов как частицы алюминия, магния, серы, тетраэтил свинец, угарный газ, серный ангидрид; оксид азота, является общемикробное число (ОМЧ). Особо чувствительны к техногенным воздействиям бактерии. Также уменьшается число аммонификаторов, азотобактера. Отмечено, что промышленные загрязнения почти в два раза уменьшают биомассу бактерий в почве.
Круглов Ю. В (1991) отмечает, что под действием атразина меняется аль-гологический состав почвенной альгофлоры. Наиболее чувствительными из сине-зеленых водорослей оказываются Amorphonostoc punctiforme, Anabaena sp., Cylindrospermum sp., Phormidium curtum, Chlamydomonas gloeogama, из диатомовых - Nitzschia palea. Все они надолго выпадают из альгоценоза и не проявляют себя в течение длительного времени при отмеченном воздействии.
Торжевский В. И (1981) также говорит о преимуществах альгологических методов анализа качества почв и предлагает следующий ряд чувствительности почвенных микроорганизмов по отношению к гербицидам и пестицидам: водо-росли грибы бактерии актиномицеты.
Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П., Штина Э.А. (1988) рекомендуют использовать почвенные водоросли в биомониторинге почв. В их экспериментах самая низкая из доз меди и никеля подавляла альгофлору и снижала по сравнению с контролем (чистая почва) видовое разнообразие и численность водорослей. Наиболее уязвимы при этом были желто-зеленые водоросли, наиболее устойчивы - одноклеточные зеленые. В исследовании была обнаружена экологическая адаптация использованных штаммов: Nostoc miiscorum 137, выделенный из шламового отвала с никелем, оказался более устойчивым к высоким дозам этого металла. Также в почвах, загрязненных металлами, не появлялось никаких новых видов в сравнении с контролем. В водных культурах металлы во всех концентрациях были более токсичными.
Модельные опыты по изучению влияния ряда солей тяжелых металлов на биосенсор «Эколюм»
Проводили серию модельных экспериментов по изучению токсического влияния на биосенсор ряда солей тяжелых металлов. При постановке модельных опытов нами были использованы данные наблюдений зарубежных специалистов, посвященные определению границ применения бактериальных люминесцентных биосенсоров в оценке степени токсичности ряда ксенобиотиков (Hauser et al. 1997; Kong et al., 1995; Paton et al., 1997).
В качестве модельных поллютантов нами были выбраны соли ряда тяжелых металлов (ТМ) - сульфата кадмия (II) - CdSC 4, сульфата меди (II) пяти водного - CuS04x5 Н20, нитрата свинца (II) - Pb(N03)2, сульфата цинка (II) семи водного - ZnS04X 7Н20.
Выбор токсикантов для модельных экспериментов, концентраций их растворов основывались на результатах исследований состояния почв г. Калуга, проведенных кафедрой ботаники и экологии КГПУ им. К. Э. Циолковского в 1995-98 гг.; выбранные тяжелые металлы относились к наиболее часто встречающимся в исследованных пробах почв городской территории, а концентрации их растворов в модельных опытах соответствовали количественному содержанию токсикантов в изученных почвах.
Токсическое влияние водных растворов солей тяжелых металлов определяли согласно методике (Методические рекомендации по определению токсичности воды и водных экстрактов из объектов окружающей среды по интенсивности биолюминесценции бактерий. Государственный Комитет санитарно-эпидемиологического надзора Российской Федерации, 1996). Время экспозиции исследуемого химического вещества с рабочей культурой биосенсора составляло 30 минут. Опыт проводился в 3-х вариантах, затем подсчитывали среднее арифметическое значение индекса токсичности.
Результаты данной серии модельных экспериментов представлены в таблице I6.
Как следует из данных, представленных в таблице 1., все водные растворы исследуемых солей тяжелых металлов в рассмотренных концентрациях явились сильно токсичными (Т 50) по отношению к биосенсору «Эколюм».
Во всех вариантах и сериях опытов, кроме серии с CdS04 в концентрации 2 мг/л, наблюдалось практически полное, 100%-ное угнетение светимости биосенсора.
На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:
1. Водные растворы данных солей тяжелых металлов в изученных концентрациях, по своему воздействию на бактериальный люминесцентный биосенсор «Эколюм», являются сильно токсичными химическими соединениями.
2. Биосенсор «Эколюм» является адекватным сенсором для обнаружения данных токсических веществ в спектре указанных концентраций в воде, водных почвенных вытяжках, водных вытяжках объектов окружающей среды; можно предположить, что биосенсор «Эколюм» будет являться высокочувствительным биотестом к действию высоких концентраций других химических соединений, обладающих эффектом токсического влияния на живые организмы (соединения др. тяжелых металлов, разнообразные органические соединения и др.).
Изучали степень ослабления токсического влияния исследуемых химических соединений почвой и чувствительность биосенсора "Эколюм" по отношению к естественно уменьшенным дозам токсикантов в модельных опытах.
Для эксперимента были отобраны образцы почв, оцененные как «не токсичные» (согласно тест-реакции биосенсора «Эколюм») и принадлежащие к почвенным уровням 1 и 2, соответственно.
Навеску почвы массой 5 г заливали, в соотношении 1:5, водным раствором соли тяжелого металла в тех же концентрациях, что и в предыдущих модельных экспериментах. Водно-почвенная суспензия тщательно взбалтывалась и помещалась на экспонирование в течение 2-х часов. Затем надосадочная жидкость фильтровалась. Экспозиция фильтрата с рабочей культурой биосенсора составляла 30 минут. Опыт проводился в 3-х повторностях, затем определяли среднее арифметическое значение индекса токсичности.
Были получены следующие результаты (рис. 16 - 19). Во всех вариантах опыта для РЬ и Cd наблюдалось ослабление почвой эффекта токсического влияния на биосенсор «Эколюм» данных тяжелых металлов (рис. 16 - 17). В вариантах с Си и Zn при максимальных значениях концентраций (200 мг/л для Си, 200 и 300 мг/л для Zn) индекс токсичности Т надосадочной жидкости принимал значения, аналогичные значениям Т для водных растворов токсикантов (рис. 18-19).
Была экспериментально подтверждена высокая аккумулирующая способность почв по отношению к изученным токсикантам в модельных опытах (рис. 16 - 19). При этом не было выявлено достоверных различий в аккумуляции водных растворов токсикантов образцами почв, отобранных с почвенных уровней 1 и 2.
На основании проведенных модельных опытов можно констатировать, что биосенсор «Эколюм» является адекватным сенсором для оценки степени токсичности стандартно приготовленной водной почвенной вытяжки, достаточно объективно отражающей состояние анализируемой почвы.
Методика оценки суммарной токсичности образцов почвы с использованием тест-объекта бактерий Bacillus subtilis
Подготовка рабочей культуры тест-объекта. Музейная культура Вас. subtilis штамма АТСС 6633 (линия А), хранящаяся в запаянной ампуле, вскрывалась в соответствии с прилагаемой инструкцией и переносилась на питательный бульон, после чего термостатировалась 24 ч. при температуре 30 С. Далее, с целью идентификации и дальнейшего размножения культуры, производили ее стерильный пересев из питательного бульона на ряд чашек Петри с мясо-пептонным агаром (МПА). В таком состоянии материал также гермостатировался 24 ч. при 30 С. После этого выросшие колонии были идентифицированы методом световой микроскопии как колонии Вас. subtilis. Для получения накопительной культуры Вас. subtilis, был проведен стерильный пересев материала с чашек Петри на пробирки со скошенным агаром (агаровые косяки). Засеянные методом "штриха", пробирки термостатировались 24 ч. в при температуре 30 С.
Поскольку бактериальный материал надлежало сохранить для жсперимента и проведения возможных дополнительных исследований, подготавливали ряд ампул со стерильной средой Кладницкого (Панкратов, Григоров, Кащенко, 1975), куда затем стерильно методом "укола" переносили культуру Вас. subtilis. Ампулы стерильно запаивались, снабжались этикетками с указанием полного названия культуры и даты засева и в таком виде сохранялись в холодильнике (линия В).
Для проведения эксперимента, из-за необходимости накопления больших масс бактерий, выращивали суточную культуру - линию С. Для этого культуру бактерий линии В переносили на пробирки со скошенным агаром и термостатировали 24 ч при 30 С. Затем накопительную культуру экстрагировали 0,85% раствором NaCl в качестве физиологического раствора. Полученную бактериальную суспензию по капле стерильной пипеткой переносили в пробирку, стерильно заполненную физиологическим раствором. После внесения каждой порции суспензии, пробирку встряхивали и сравнивали со стандартом мутности для получения бактериальной суспензии с концентрацией микроорганизмов 5 ед.
Методика эксперимента по оценке состояния почв . Стандарти о отобранные почвенные пробы были использованы для получения почвенных водных вытяжек (Орлов и др., 1991). Полученные водные вытяжки образцов почв концентрировали упариванием в 10 раз для усиления эффекта токсического воздействия, а также приведения концентрации экстрагированных химических веществ к концентрации их в почвенном растворе. Для исключения возможности развития на питательных средах каких-либо иных, кроме Вас. subtilis, микроорганизмов, концентрированная водная почвенная вытяжка подвергалась стерилизации при 1атм и 121 С в течение 25 мин.
В ряд стерильных пробирок вносили по 3,5 мл исследуемых почвенных вытяжек (в опыте) или физиологического раствора (в контроле) и добавляли стерильной пипеткой на 0,2 мл по 1 капле полученной бактериальной суспензии; пробирки термостатировались 24 ч при 25 С (Красильников, 1948).
Затем вносили по 1 мл такого материала в ряд стерильных пробирок, содержащих по 9 мл физиологического раствора. На стерильные чашки Петри с МПА засевали по 0,5 мл полученного материала. Последующее термостатирование велось 24 ч. при 29,9 С. Затем подсчитывали число образовавшихся колоний. Обработка полученных данных проводилась по формуле:
Х= (А+В+С)/3) х Р х 700, где:
X - число колоний микроорганизмов на всей поверхности засева при воздействии вытяжки без учета разведений;
А, В,С - подсчитанное число колоний микроорганизмов на участках, площадью 1 кв. см. каждый;
Р - площадь поверхности чашки Петри, занятая питательной средой;
700 - коэффициент разведения.
Опыт проводился в 3-х повторностях, затем высчитывали среднее значение.
Микроботоксичность почвенных образцов оценивали:
по проценту выживания бактерий Р, который определяли по формуле Р= (В/В0) х 100, где значения В и В0 соответствовали численности колоний тест-объекта в опытном и контрольном вариантах; при этом абсолютное значение Р тем больше, чем менее токсичен исследуемый субстрат.
по индексу микроботоксичности X, который определяли по формуле Х= (Во-В)/В0; при этом абсолютное значение индекса X тем больше, чем более токсичен исследуемый субстрат.
Оба показателя адекватно описывают степень токсичности изученных почвенных образцов и могут использоваться наравне друг с другом как результирующие величины проведенной оценки.
Сравнительный анализ данных микробиоиндикационных (по тест-реакции Bacillus subtilis), химико-аналитических фитобиоиндикационных методов оценки качества почвы селитебных территорий
С целью обоснования объективности использования бактерий Bacillus subtilis в качестве тест-объекта при оценке состояния почв селитебных территорий, проводили ряд сравнительных анализов данных, полученных при помощи разных методов изучения качества почв.
С этой целью сопоставляли картографическую информацию о химическом загрязнении почв г. Калуга и локализацию точек отбора почвенных проб. Было установлено, что пробы почв, обладающие повышенной токсичностью, были отобраны на территориях с повышенным суммарным загрязнением Zn, Pb, Cr, Ni, Co, Cu, Mn, Sr, Sn (рис. 38 - 39).
Как следует из проведенного сравнения, увеличение микроботоксичности, определенного по тест-реакции бактериального тест-объекта характерно для территорий, почвы которых подвержены интенсивному техногенному загрязнению (рис. 38 - 39). Подобного рода закономерность позволяет предположить, что использование бактерий Вас. subtilis в качестве тест-объекта при оценке качества почвы селитебных территорий является оправданным; разработанный метод может выступать как приоритетный перед химико-аналитическим определением содержания поллютантов в почвах.
Определяли коэффициент корреляции индекса микроботоксичности почв, установленного по тест-реакции Вас. subtilis (таб. 6), и коэффициента флуктуирующей асимметрии листовых пластинок некоторых растений. При этом расчетное значение коэффициента флуктуирующей асимметрии определяли с помощью авторской компьютерной программы Vespa Plus (Шпынов, 1998).
Достоверное коррелятивное соотношение в распределении индекса микроботоксичности и коэффициента флуктуирующей асимметрии было установлено для следующих территорий и видов растений: для Tussilago farfara L. - 0,67 и для Acer negundo L. - 0,68 (пойма p. Терепец); для Tilia cordata Mill. - 0,74 (юго-восток г. Калуги, промышленная зона).
Тренды распределения анализируемых показателей рассматривали как графическое отображение установленных закономерностей (рис.40 - 42). Графический анализ трендов показал сходность направления и амплитуды их изменения. Следует указать, что данные закономерности были установлены для почв территорий, подвергающихся антропогенному воздействию, подчас весьма интенсивному.
Также изучали соотношение индекса микроботоксичности почв и показателя фитотоксичности почв, определенного по тест-реакции проростков пшеницы. Положительная достоверная корреляция была доказана в экспериментальных условиях14 (рис. 43).
Все рассмотренные закономерности закономерности (рис. 40 - 43) были установлены для почв территорий, подверженных интенсивному антропогенному воздействию. Как следует из трендов распределения показателей, тенденции и амплитуды их изменения имеют сходный характер и объективно интерпретируют состояние обследованных почв. Данный факт свидетельствует об обоснованности использования бактерий Вас. subtilis как тест-объекта при проведении оценки состояния почв селитебных территорий методами микробиоиндикации.
Подытоживая результаты исследования возможности использования бактерий Вас. subtilis как тест-объекта при изучении состояния почв селитебных территорий следует также отметить, что, по нашему предположению, на основании результатов оценки состояния почв допустимо предложить создание балльной шкалы оценки токсичности почв; в случае реализации подобного вида оценки почв, балльная оценка явилась бы более наглядной, а ранжированные, на ее основании, территории - более доступными для сопоставительного анализа. Безусловно, это - теоретическое предположение; при разработке самой балльной шкалы, критериев ранжирования показателей бактериотоксичности почвы, по балльного распределения их как параметров качественной оценки, необходимо будет самое тщательное и всестороннее обоснование осуществляемого подхода и его стадий. Тем не менее, создание такой шкалы потенциально возможно. Так, в качестве примера, можно привести следующие варианты системы распределения значений показателей бактериотоксичности.
В случае ранжирования процента выживания бактерий Р, за 100% (5 условных баллов) можно принять рост контрольной группы бактерий, за 0% (0 баллов) - отсутствие роста колоний; в случае ранжирования индекса микроботоксичности X закономерность будет обратной, а градация величин индекса - от 1 (5 баллов) до 0 (0 баллов). В соответствии с этим, все фактические значения обоих показателей будут распределяться по 5 группам: от 0 до 20%,... и т.д., либо - от 1 до 0,8,... и т.д.
В другом варианте логическая основа остается той же, но за наиболее высокий и наиболее низкий балл берутся максимальное и минимальное значение анализируемой величины в почвах изученных территорий. Соответственно, все фактические значения показателя, располагающиеся в пределах этих экстремумов, также распределяются согласно балльной шкале. Естественно, такой вариант относительной оценки будет обусловлен территориальным фактором, привязкой к конкретной территории; он может достовернее отражать состояние почв изученной территории, но оформленные таким образом результаты будет сложно сопоставить с результатами других подобных исследований.
В любом варианте, адекватным критерием для правомерности использования балльной оценки и объективности выбранной шкалы послужил бы сравнительный анализ состояния оцененных таким образом территорий с результатами других исследований, результатами балльной оценки состояния других параметров окружающей среды.
В целом, проведенное изучение возможности использования бактерий Вас. subtilis в качестве тест-объекта при изучении состояния почвы селитебных территорий позволило установить следующее.
1. На основании экспериментальных данных, полученных рядом авторов, а также на основании результатов собственных проведенных исследований, следует рекомендовать использование бактерий Вас. subtilis в качестве тест-объекта при оценке качества почвы селитебных территорий.
2. Разработанная методика оценки токсичности почвенных образцов по тест-реакции Вас. subtilis может быть взята за основу при разработке стандартизованного теста.
3. В силу принципиального сходства результатов оценки состояния почв различными рассмотренными методами, оригинальный метод может быть оценен как адекватный и рекомендуемый к применению в комплексе методов исследования состояния почв.