Введение к работе
Актуальность темы. Одной из самых актуальных проблем современной биофизики мембран является выяснение молекулярных механизмов функционирования систем ионного транспорта клеточных мембран. Эти системы играют чрезвычайно важную роль в передаче нервного импульса и обработке информации в мозге. Они выполняют ключевую роль в синтезе аденозинтрифосфата (АТФ) - универсального носителя энергии в живых клетках, а также осуществляют другие разнообразные и важные функции.
Особый интерес для исследования представляют постсинаптичес-кие рецепторы ГАМК и протонная АТФаза. Этот интерес обусловлен тем, что ГАМКергические синапсы являются одними из важнейших элементов мозга, обеспечивающих передачу и обработку сигналов. Кроме того, синапсы данной медиаторной природы являются наиболее распространенными тормозными синапсами и составляют до 20-40% от всех синапсов мозга млекопитающих (Tower, 1976). В то же время протонная АТФаза играет определяющую роль в синтезе АТФ в нервных клетках мозга, а также во многих других"типах клеток (Kagawaet al. , 1979). Следовательно, постсинаптические рецепторы ГАМК и протонная АТФаза являются одними из главнейших систем ионного транспорта клеточных мембран мозга.
К настоящему времени установлена первичная последовательность отдельных субъедиц рецептора ГАМК и" протонной АТФазы, появились ноЕые чувствительные электрофизиологические методы, которые позволяют оценить параметры отдельных ионных каналов рецептора. Однако, несмотря на достигнутые результаты, проблема расшифровки пространственной структуры и физических принципов функционирования вышеуказанных, а также и всех других мембранных белков, остается до настоящего времени по существу неисследованной. В то же время решение даже некоторых задач этой проблемы позволяет не только продвинуться в понимании фундаментальных физико-химических механизмов работы мозга, но также дает возможность целенаправленно вести поиск физических и химических факторов внешней среды, оказывающих заданное воздействие на центральную нервную систему.
Существует множество надежных предпосылок для утверждения, что реконструкция в искусственной мембране таких молекулярных устройств как рецептор ГАМК и Н+-АТФаза и их исследование при' помощи техники изучения одиночных каналов позволит достичь
- 4 -значительного прогресса в понимании физических принципов их функционирования.
Можно предположить, что прорыв в исследовании пространственного строения и молекулярных основ функционирования йонотранс-портных клеточных систем будет достигнут в значительной степени благодаря применению моно- и поликлональных антител, обладающих уникальными свойствами высокоспецифического связывания. Для достижения указанной цели актуальное значение имеет расшифровка практически неизвестных молекулярных физических механизмов взаимодействия антител с ионными каналами.
Важное фундаментальное и практическое значение имеет исследование изменений свойств реконструированных синаптических структур под воздействием электромагнитных полей. Неотложность решения этой задачи вызвана повышением интенсивности электромагнитных полей, воздействующих на мозг и весь организм человека, вследствие развития современной техники.
Для разработки указанного комплекса фундаментальных и практических проблем можно сформулировать следующую цель работы.
Цель работы. Выяснить биофизические свойства и механизмы функционирования реконструированных клеточных систем ионного транспорта, играющих фундаментальную роль в обработке информации и энергетике в мозге: синаптических рецепторов ГАМК и протонной АТЇвзьі. Для создания научной основы применения антител в исследовании пространственной организации и молекулярных принципов функционирования клеточных систем ионного транспорта расшифровать молекулярные механизмы взаимодействия ионных каналов с моно- и поликлональными антителами.
Основные задачи исследования. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
-
Развить перспективное направление в исследовании клеточных систем ионного транспорта на основе разработки нового метода реконструкции таких систем в плоском липидном бислое, отличающегося от известных способов высокой эффективностью и универсальностью.
-
Экспериментально исследовать и проанализировать основные физико-химические свойства и принципы функционирования таких важнейших транспортных мембранных систем как рецептор гамма-аминомасляной кислоты из синапсов мозга крысы и протонная АТФаза, реконструированных в липидном бислое при помощи нового
- 5 -разработанного метода.
3. Экспериментально исследовать и развить теоретические
представления о молекулярных физико-химических механизмах взаимо
действия реконструированных простейших и хорошо изученных ионных
каналов (образованных амфотерицином Б и ji-латротоксином) с поли-
и моноклональными антителами, а также расшифровать пространст
венную структуру комплексов, образованных каналами и молекулами
антител.
С целью выяснения структуры рецептора ГАМК и принципов его функционирования при помощи антител определить взаимную прост-ранственую локализацию ионного канала и места связывания медиатора на реконструированном рецепторе.
-
Экспериментально исследовать возможность реконструированных синапгических рецепторов мозга изменять свои свойства при воздействии электромагнитных волн УВЧ диапазона, направление и физические механизмы этих изменений.
-
Проанализировать и обобщить полученные результаты для создания нового фундамента в исследовании пространственной организации и молекулярных основ функционирования реконструированных клеточных систем ионного транспорта при помощи целенаправленного применения антител.
Научная новизна. Полученные результаты имеют следующую
принципиальную новизну. &
-
Разработано перспективное направление в исследовании клеточных систем ионного транспорта на основе разработки нового метода реконструкции таких систем в плоском липидном бислое, отличающегося от известных способов высокой эффективностью и универсальностью.
-
С помощью разработанного нового метода впервые реконструирован в липидном бислое рецептор ГА1Ж из мозга и определены основные физико-химические характеристики одиночных реконструированных рецепторов. Показано, что мозг содержит рецепторы ГАМК, имеющие разные типы ионных каналов: одни при взаимодействии с ГАМК открывают в мембране хлорные каналы, другие - катионные
(Na , К ) каналы.
-
Впервые показано, что при протекании на липидном бислое фермент-субстратной реакции в липидной мембране возможно образование одиночных ионных каналов.
-
С помощью разработанного нового метода Епервые произве-денно встраивание функционирующей протонной АТФазы в плоскую
бимолекулярную лшидную мембрану, что позволило экспериментально с помощью прямого измерения количественно определить основные электрические характеристики АТФазы в ЕЛЕ Известные до сих пор способы оказались непригодными для реконструкции рецептора ГАМК и протонной АТФазы в плоском бислое.
-
Впервые расшифрован молекулярный физико-химический механизм взаимодействия ионных каналов с поли- и моноклональ-ными антителами и установлено пространственное строение каналов, модифицированных антителами.
-
Показано, в результате впервые проведенного экспериментального исследования,_ что свойства модельной мембраны со встроенными синапгическими рецепторами ГАМК изменяются при воздействии на нее электромагнитного поля УВЧ диапазона. Обнаружен механизм такого воздействия.
-
Из вышеперечисленного следует, что в работе создан фундамент нового направления, основанного на реконструкции и целенаправленном применении антител, в исследовании пространственной организации и молекулярных основ функционирования клеточных систем ионного транспарта, играющих важную роль в жизнедеятельности организма.
Практическая ценность. Разработка нового универсального метода реконструкции мембранных белков открывает возможность быстрого и эффективного исследования физических принципов функционирования на молекулярном уровне не только рецепторов ГАМК и протонной АТФазы, но и других самых разнообразных клеточных систем ионной проницаемости, что может быть примененным в биофизических и других исследованиях.
Реконструкция рецепторов ГАМК из мозга крысы и протонной АТФазы в модельной мембране позволила выяснить электрические свойства данных важнейших клеточных систем ионного транспорта, что имеет большое значение в понимании фундаментальных физико-химических механизмов работы мозга на молекулярном уровне. В то же время это открывает ноеьіє возможности для целенаправленного поиска физических и химических факторов внешней среды, воздействующих на центральную нервную систему в заданном направлении.
Создание модельных мембран со встроенными рецепторами ГАМК и протоной АТФазой открывает уникальные возможности для быстрого и дешевого скрининга веществ, которые могут оказывать высокоэффективное действие на данные белковые системы. Это может найти широкое применение в медицине.
С другой стороны, поскольку рецепторы ГАМК играют важную роль в нейромышечном соединении многих насекомых - вредителей сельского хозяйства, то расшифровка принципов функционирования данного рецептора и его реконструкция в БЛМ дает удобную возможность быстрее и эффективнее проводить поиск веществ, уничтожающих данных вредителей.
Выясненные закономерности воздействия электромагнитных волн УВЧ диапазона на синаптические структуры мозга имеют исключительно Бажное значение в связи с развитием современной техники и повышением интенсивности электромагнитных полей, воздействующих на мозг и таким образом на весь организм человека.
Расшифровка молекулярного механизма взаимодействия реконструированных одиночных ионных каналов с антителами создает научную основу для применения моноклональных антител в исследовании структуры и физических принципов функционирования разнообразных клеточных систем ионного транспорта.
В связи с тем, что структура антигенных рецепторов Б-лимфоцитов похожа на структуру антител и поскольку ионные каналы являются антигенами, то расшифровка указанного механизма имеет принципиальное значение для выяснения молекулярного механизма ра-Ооты рецепторов этих важнейших клеток иммуной системы.
Последнее направление имеет также самостоятельное значение и в иммунологии. Это обусловлено тем, что связывание антитела с клеточной мембраной, вследствие последующего взаимодействия комплекса антиген-антитело с комплементом, приводит к деградации мембраны. Данный процесс играет важную роль в утилизации чужеродных клеток.' Знание изученных в диссертации физико-химических свойств комплекса, образованного ионными каналами с антителами, позволяет приступить к исследованию биофизических аспектов данного явления и более эффективно воздействовать на утилизацию чужеродных клеток в организме.
Публикации. Результаты, вошедшие в диссертацию, опубликованы в 42 печатных работах (из них 12 в ведущих международных изданиях) , а также доложены на Всесоюзных конференциях по биофизике мембран в Паланге, 1973 и 1979 г.; VII Всесоюзной Нейрохимической конференции, Ростов-на-Дону, 1976 г. ; Всесоюзном симпозиуме "Нейромедиаторы в норме и патологии", Казань, 1979; Всесоюзном рабочем совещании по действию электромагнитных полей на простейшие биологические системы и их модели; Пущина, 1979; Есесоюзных симпозиум.ах по закономерности биологического действия
- 8 -неионизируюших электромагнитных излучений в Пущино в 1980, 1982 и 1987 гг.; I Всесоюзном биофизическом съезде, Москва, 1983; III Всесоюзном симпозиуме "Липиды биологических мембран", Пущино, 1984; IV и V Всесоюзном рабочем совещании по биоэлектрохимии мембран в Риге в 1985 и в Ленинграде в 1986 г.; Всесоюзном симпозиуме "Одиночные ионные каналы в биологических мембранах", Пущино, 1985; 3-ем Всесоюзном рабочем совещании "Блокаторы ионных каналов", Пущино, 1987 г. ;
XIX Генеральной ассамблее международного союза радионаук (URSI), Хельсинки, Оинляндия, 1978 г.; II Международной школе "Структура и функция биомембран", Варна, НРБ; III Советско-Швейцарском Симпозиуме "Биологические мембраны: структура и функция", Ташкент, 1983; 8-м Международном биофизическом конгрессе, Бристоль, Великобритания, 1984 г.; 16-ом симпозиуме Европейского биохимического общества (FEBS), Москва, 1984 г.; III Симпозиуме СССР-ФРГ "Возбудимые мембраны", Киев, 1987 г.; Международной симпози-умепо действию зарядов и полей б биосистемах, Ричмонд, США, 1989. Диссертация прошла апробацию на совместном заседании секций по биофизике мембран и физической среде Ученого Совета Института биофизики АН ССС, а также на биофизическом семинаре Научно-технического объединения АН СССР.
Структура диссертации. Диссертация содержит введение, 10 глав, вьводы и список литературы. Объем диссертации 363 страницы, в том числе 76 рисунков, 3 таблицы и 256 названий цитируемых литературных источников. Во введении и в главе 1 рассмотрено современное состояние исследуемой проблемы, формулируются актуальность, основная цель работы,- задачи исследования, показана научная новизна и практическая значимость работы. В главе 2 изложены основные используемые материалы и методы. В главе 3 описан созданный новьй метод реконструкции мембранных белков в липидном бислое. В главах 4 и 5 изложены свойства рецептора ГАМК и протонной АТФазы, встроенных в БЖ В главе 6 изложены свойства липид-ного бислоя при протекании на нем фермент-субстратной реакции, показана необходимость правильного выбора параметров, характеризующих нативное состояние реконструированных ионотранспортных систем. В главах 7-9 описывается исследование молекулярного механизма взаимодействия антител с ионотранспортными системами, встроенными в липидный бислой. В главе 10 выяснен механизм воздействия УВЧ электромагнитного поля на рецептор ГАМК. В конце диссертации сформулированы основные результаты и выводы.