Биофизические аспекты физиологического действия экзогенного О2 на животных Гольдштейн, Наум Исаакович

Введение к работе

Актуальность темы. Представления о повреждающих эффектах свободнорадикальных или радикалообразующих продуктов одноэлектронного восстановления кислорода в биологических системах являются доминирующими в течение последних трех десятилетий. Основное внимание привлекают такие формы активированного кислорода, как супероксидный радикал 0₂*~, пероксид водорода Н2О2, синглетный кислород '0₂, гидроксильный радикал 'ОН, а также липидные радикалы образующиеся в частности в жидкой фазе при распаде гидроперекисей липидов ROOH (Владимиров и др., 1975; Halliwell 1995; Скулачев, 1996; Скулачев, 1999). В многочисленных исследованиях было убедительно показано что окислительные деструктивные процессы вызываемые повышенными уровнями активированных (Ьорм кислорода в конденсированной водной (Ьазе а также липидными радикалами и гидроперекисями могут лежать в основе клеточной патологии и сопряженных с нею заболеваний. В целом результаты этих исследований можно рассматривать как развитие проблемы свободнорадикальной патологии и перекисного окисления в биологических структурах (Тарусов, 1964; Эмануэль, 1964). С этих позиций в настоящее время интерпретируются механизмы сердечнососудистой патологии и артериосклероза (Halliwell Gutteridge, 1988) дегенеративных заболеваний нервной системы (Delanty, Dichter 1998), аутоиммунных и хронических воспалительных заболеваний (McCord, 1985), старения (Harman, 1968), злокачественного роста (Oberley, Oberley, 1993) и др.

Не менее важными, однако значительно менее изученными, являются представления о биологической роли кислородных радикалов и процессов перекисного окисления в условиях физиологической нормы. Между тем, накапливается все больше фактов, указывающих на важную роль этих активных продуктов и процессов в нормальной жизнедеятельности. Так, отметим представления о важной роли процессов перекисного окисления липидов в функционировании митохондрий в норме (Владимиров и др., 1975). Известно также, что обусловленная генетической неполноценностью нейтрофилов недостаточная продукция

СУп ЄПОКС И 713. ГТПИ ХПОНИЧРСКОМ тянуттпматотр вПРЧРХ за СОООЙ HflnVTIIенUG

гтотийОїїосґіагтитрiti»ht»tv механтпмли и ttоrmtttphhwu риpv ги^Ргти органи'чм'я от инфркттии (Hohn Leпгйт" 197S^ Этот гтпимртї лтпя'ж'ярт¹ опну m няи^лттрр гтоггнп тплатрннмтг погтрчнмх

био rTOrW4Pf*IfWV (ТЇЛГНК'ТГИЙ І^Л/ГТРОПТ^РИТТЯ ГТТЮ iTVTTWnV^lVjf ПГҐЇ акт^НИТЛППЯІТМТ^ТМ W п"ІЯГ^чЛТТ1'Т*ТЯМТ 1Л

связанную с бактерицидным действием этого радикала (Babior et al 1973") В последнее клеток белой kdobh (Fumkava et al 1992; Kimura et al 1993) Регуляторное участие

активированных форм кислорода в жизнедеятельности клетки в норме установлено в процессах клеточного деления (Steinbeck et al., 1994; Moulton et al., 1998), экспрессии генов (Dalton, 1999) и апоптоза (Burdon et al., 1996; Del Bello et al., 1999), a также в реакциях неферментативной регуляции окислительного стресса (Halliwell, Gutteridge, 1989). В связи с проблемой роли кислородных радикалов в норме обращает на себя внимание ряд не получивших до сих пор объяснения фактов, в первую очередь таких как i) относительно высокая доля кислорода, превращаемого в клетке в активированные формы, достигающая в ряде случаев в покое 10-15% (Oshino et al., 1975; Shoaf et al., 1991), ii) многообразие внутриклеточных процессов одноэлектронного восстановления кислорода, приводящих к образованию 0₂"~ (McCord, 1995) и Hi) относительное постоянство его внутриклеточной концентрации (Elstner, 1990). Следует согласиться с мнением McCord (1995) о том, что наше понимание биологической - в широком смысле - роли супероксида в нормальном метаболизме клетки остается неполным.

Другой важный аспект этой проблемы в целом, в рамках которого и выполнена настоящее исследование, заключается в том, что существующие в настоящее время представления о роли радикалов О2" основаны исключительно на исследованиях, проведенных в конденсированных средах - водных растворах, суспензиях клеток и субклеточных частиц, а также в тканях. Между тем, для большинства наземных многоклеточных организмов нормальной средой обитания является газовая фаза - атмосфера. В атмосферном воздухе постоянно присутствуют электрически заряженные частицы, представленные ионизированными молекулами составляющих воздух газов и свободными электронами, образующие~пул~т.н. „аэроионов". К относительно стабильным компонентам аэроионного пула относятся, в частности, кислородные ионы Ої~. Образование этих ионов, представляющих в современной трактовке анион-радикал О2 ~ постулировалось различными авторами (Чижевский, I960; Loeb 1967; Krueger Smith 1968). В газовой фазе устойчивость Ог*~ как иона в значительной мере обусловлена формированием кластеров типа СЬ*~»(НіС0п fKrueger Sigel 198її Физические гтпоттрггтл игшияяттии кислоротта и лпугих атмпгіЬрпнтлу газов изложены в обзорах и монотягЬиях (\ npb 1967;Pethif? 1984;По1е7ЯІе!с 1985^

Описанные в научной литературе биологические эффекты отрицательных аэроионов обусловлены у высших животных преимущественно воздействием на ЦНС, включая подкорковые структуры и кору головного мозга (Овчарова, 1966; Скоробогатова, 1991). Рефлекторное действие атмосферных газовых ионов может быть реализовано в форме физиологических ответов на изменения поверхностного электрического заряда, проницаемости и ферментативной активности клеток в области носоглотки (Финогенов, I960

и 1962; Скоробогатова, 1964). Биологические механизмы усиления реакций целостного организма на атмосферные ионы включают вовлечение на подкорковом уровне гипоталамуса (Olivereau, 1970) и гипофиза (Olivereau, Bousquet, 1974), а также функционально связанной с ними коры надпочечников (Wasilewski et al., 1955). Описаны также реакции со стороны других контролируемых аденогипофизом желез внутренней секреции - щитовидной (Gualtierotti, 1968) и гонад (Bocconi, 1970). В то же время, существующие представления и факты о биологическом действии аэроионов, в том числе (^"-содержащих отрицательных аэроионов, крайне противоречивы. Это обстоятельство послужило основанием для формирования у некоторых авторов скептического отношения к отрицательным аэроионам как биологически активному фактору воздушной среды (Ritter, 1985). Высказываются также сомнения относительно описзяных в ряде работ физиологических и терапевтических эффектов искусственно генерируемых отрицательных кислородных ионов (Kroling, 1985; Charry, 1987).

Проведенный нами анализ работ, опубликованных в этой области в период с 1930 по 1990 гг., показал, что основной причиной противоречивости экспериментальных исследований биологической роли и лечебного действия аэроионов является отсутствие надежных методов селективной генерации биологически активных компонентов пула отрицательных кислородных ионов. Между тем, именно эти компоненты и, главным образом, супероксид, нам представляются наиболее важными и интересными.

Биологическая активность атмосферных ионов у млекопитающих реализуется, преимущественно, в результате ингаляции в процессе дыхания. Специфика ингаляционного способа воздействия анион-радикала супероксида газовой фазы на организм обусловлена следующим. Физико-химические характеристики радикала (высокая реакционная способность и короткое время жизни в протон-содержащей водной среде слизистых оболочек носовой полости и носоглотки), особенности строения и физиологии полости носа (вихревой характер движения воздушных потоков и 100%-ное насыщение вдыхаемого воздуха парами воды) позволили заключить, что реализация химической активности ингалируемого радикала Ог" возможна, преимущественно, на уровне слизистой оболочки носовой полости. В этом случае можно ожидать появления физиологических эффектов, обусловленных активацией нервных центров и структур, анатомически и функционально связанных с хеморецепторами полости носа. Существование такого предположенного нами физиологического механизма согласуется с известными данным о функциональной активации гипоталамуса аэроионами (Olivereau, 1970). Кроме того, следовые количества пероксида водорода, относительно стабильного продукта дисмутации супероксида, могут проникать в дистальные отделы дыхательного тракта, вьпывая как местные реакции, так и

рефлекторные ответы со стороны бронхов и легких. Это объясняет известные из литературы физиологические реакции глубоких отделов дыхательной системы (Булатов, 1962; Скоробогатова, 1966), недоступных для проникновения собственно заряженных кислородных ионов.

Таким образом, учитывая, что кислородный радикал 0₂"~ как составная часть отрицательных аэроионов является постоянным высокоактивным компонентом естественной воздушной среды, понимание механизмов взаимодействия супероксида газовой фазы с биологическими объектами представляет несомненный интерес. Развитие этого научного направления, несомненно, должно способствовать формированию новых представлений о биологической роли кислородных радикалов и процессов перекисного окисления при патологических процессах и в условиях физиологической нормы.

В связи с вышеизложенным, OJ .новной целью настоящей работы явилось выяснение биологической роли атмосферного супероксида и механизмов его действия на живые системы, а также изучение процессов адаптации организма к активированным формам кислорода атмосферного воздуха в норме и в условиях экспериментальной и клинической патологии.

Основные задачи работы включали:

1. создание способа селективного генерирования супероксида Oz" в газовой фазе и исследование физико-химических, биофизических и биохимических свойств этого радикала;

2. разработку генератора - источника супероксида газовой фазы для экспериментальных биофизических и физиологических исследований и клинического применения;

3. комплексное исследование биологической активности искусственно продуцируемого супероксида и продуктов его превращений при прямом действии в различных моделях на клетках и тканях, а также на целостном организме животных при ингаляционном пути поступления в организм;

4. определение параметров общей токсичности и местного раздражающего действия супероксида газовой фазы и низких концентраций пероксида водорода при ингаляционном пути поступления в организм животных;

5. изучение биологической роли атмосферного супероксида в условиях его элиминации из вдыхаемого воздуха (депривации);

6. исследование эффективности лечебного действия низких концентраций и/или доз активированного кислорода (супероксид, пероксид водорода) при заболеваниях и

состояниях, связанных с усилением эндогенного окислительного стресса, сопровождающихся нарушением метаболических, регуляторных и иммунных механизмов (болезнь Паркинсона, болевой синдром, бронхиальная астма).

Научное значение и новизна работы определяются тем, что:

доказана идентичность общебиологических и физиологических эффектов 0₂~ воздушной среды и отрицательных аэроионов;

установлена биологическая активность супероксида газовой фазы: 1) при прямом воздействии на биологические объекты на клеточном и тканевом уровнях (микроорганизмы, лейкоциты, ткани in vivo и in situ, а также 2) при воздействии на целостный организм млекопитающих (лабораторные животные, человек) при ингаляционном способе поступления в организм;

показано, что физиологическое действие экзогенного супероксида на целостный организм обусловлено физико-химическими свойствами, характерными для активированных форм кислорода (супероксид, пероксид водорода), и опосредовано преимущественно стимуляцией рецепторов слизистой оболочки носовой полости, связанных с подкорковыми структурами головного мозга;

установлено, что механизмы биологического действия супероксида газовой фазы на организм млекопитающих, опосредованные рецепторами слизистой оболочки носа, включают уменьшение эндогенного окислительного стресса, активацию гипоталамо-гипофизарно-адреналовой системы, ингибирование активности моноаминоксидаз тканей мозга, и что' эти эффекты вовлечены в комплекс физиологических реакций , вызванных изменениями естественных уровней атмосферного супероксида;

показана эффективность лечебного применения ингаляций низких концентраций супероксида и низких доз пероксида водорода в экспериментальных моделях на животных, а также в модели боли у человека и у больных (болезнь Паркинсона и бронхиальная астма) и установлено, что механизмы лечебного действия изученных кислородных интермедиатов включают активацию допаминэргической и серотонинэргической нейромедиаторных систем мозга, что сопровождается уменьшением уровня эндогенного окислительного стресса;

обоснованы и развиты представления о роли супероксидного радикала Ог" как жизненно необходимого физико-химического фактора воздушной среды и показано, что в условиях депривации атмосферного супероксида развиваются патологические изменения, ведущие к ускоренной гибели животных, тогда как введение в воздушную среду супероксида в

газовой фазе способствует восстановлению нарушенных функций к предотвращает гибель депривированных животных;

- выдвИнута гипотеза о связи между эволюционным формированием основных клеточных
функций и присутствием в „бескислородных" условиях на ранних этапах эволюции
клетки абиогенных активированных форм кислорода, и с этих позиций приведены
аргументы в пользу существования эволюционно детерминированной потребности в
супероксиде для реализации жизненных функций современных организмов.

Практическое значение диссертационной работы заключается в том, что

исследованы условия и разработан способ генерации супероксида в газовой фазе, на основе которого созданы защищенные патентами устройства для генерации супероксида, применимые в условиях биофизического и физиологического эксперимента, а также первые ингаляторы супероксида SARTRON и pro-inhal*, предназначенные для лечебных целей, и освоено промышленное производство последнего;

разработаны и прошли клиническую апробацию способы клинического применения ингалятора супероксида pro-inhal* для лечения больных бронхиальной астмой;

разработаны способы повышения антиноцицептивного действия анальгетиков, основанные на эндоназальном применении активированных форм кислорода и применимые для лечения больных с болевым синдромом;

разработана, прошла доклинические исследования и находится на клинических испытаниях лекарственная форма на основе пероксида водорода, предназначенная для лечения больных с симптомокоплексом паркинсонизма;

теоретически и экспериментально обосновано применение ингаляций супероксида как адаптогена для предотвращения и/или уменьшения повреждающего действия физических и химических факторов;

полученные результаты могут найти применение также для дальнейшей разработки методов профилактики заболеваний, связанных с дефицитом супероксида в воздушной среде замкнутых помещений („чистые помещения", постнатальная медицина и др.).

Способ генерации и ингалятор супероксида, а также способы лечебного применения активированных форм кислорода в лечении больных с симптомокомплексом паркинсонизма и болевым синдромом обладают мировой новизной и защищены патентами в большинстве развитых стран, в том числе в России. На основе сформулированных в работе представлений и принципов возможна разработка способов лечения ряда других заболеваний и создание новых лекарственных форм.

Полученные в работе результаты и сформулированные представления открывают новое направление в исследовании биологической роли и механизмов действия экзогенных форм активированного кислорода в условиях физиологической нормы, их взаимодействия с рецепторными структурами, а также биологических процессов и реакций, развивающихся в ответ на воздействие этих продуктов. Дальнейшее изучение механизмов ответных реакций организма на различных уровнях (нейрогуморальная регуляция, иммунная система, органы дыхания) при воздействии экзогенных активированных форм кислорода может способствовать формированию новых взглядов на этиологию, патогенез и лечение возрастных заболеваний центральной нервной системы и способствовать разработке новых методов их лечения.

Апрпбапия работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на следующих конференциях, съездах, симпозиумах и совещаниях:

"Сверхслабые свечения в биологии" (Москва, 1969; Москва, 1972); 2-й Всесоюзный биохимический съезд (Ташкент, 1969); 4-й Международный конгресс по радиобиологии (Evion, 1970); "Сверхслабые свечения в медицине и сельском хозяйстве" (Москва, 1971); FV Международный биофизический конгресс (Москва, 1972); Всесоюзное совещание "Защита от вредного воздействия статического электричества в народном хозяйстве" (Северодонецк, 1973); Всесоюзное совещание "Физико-химические основы действия физических факторов на живой организм" (Москва, 1974); Всесоюзная конференция "Физико-математические и биологические проблемы действия электромагнитных полей и ионизации воздуха" (Ялта, 1975); Всесоюзный симпозиум "Свободнорадикальное окисление липидов в норме и патологии" (Москва, 1976); Всесоюзная конференция "Современные проблемы анестезиологии, реаниматологии и интенсивной терапии (Алма-Ата, 1984); Всесоюзная конференция "Применение гипербарического кислорода в медицине" (Москва, 1985); Всесоюзная конференция "Проблемы оценки функциональных возможностей человека и прогнозирование здоровья" (Москва, 1985); Всесоюзные семинары "Кислородные радикалы в химии, биологии и медицине" (Минск, 1985; Рига, 1986, 1987, 1988, 1989); Всесоюзное совещание "Транспорт кислорода и антиоксидантные системы" (Гродно, 1989); 4-й Всесоюзный симпозиум "Гипербарическая оксигенация" (Москва, 1989); Ежегодный симпозиум австрийского общества по изучению легочных заболеваний и туберкулеза (Gmunden, 1995); Ежегодный симпозиум немецкого общества по изучению легочных заболеваний (Bochum, 1996); Конгресс "Tumorschmerz" (Der 2. KongreB der Deutschen Interdisziplinaren Vereinigung fur Schmerztherapie, Nurnberg, 1997); Ежегодньй конгресс European Respiratory Society (Berlin, 1997); Ежегодный симпозиум немецкого общества по изучению легочных заболеваний (Hamm, 1997); Юбилейная конференция, посвященная 100-

летию дня рождения А.Л. Чижевского (Калуга, 1997); Международный аэрозольный симпозиум "IAS-4" (Санкт-Петербург, 1998); 2-й Российский биофизический съезд (Москва, 1999); а также обсуждались на научных семинарах и лекциях в университетах, медицинских центрах и высших учебных заведениях городов Берлин (Charite), Берлин (FU), Гамбург, Геттинген, Мюнхен, Нюрнберг, Оснабрюк, Потсдам, Саарбрюкен, Франкфурт-на-Майне, Эрфурт (Германия), Вена (Австрия), Минск (Беларусь), Рим (Италия), Рига (Латвия).

Публикации: Основные результаты представленной к защите работы отражены в 55 научных статьях, включая один обзор автора. Кроме того, по результатам исследований были получены 4 патента Германии, действующие в более, чем 20 странах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения,