Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Физико-биологическая роль гиалуроновой кислоты в биосистемах 13
1.1. Современное представление о гиалуроновой кислоте 13
1.2. Биологическая роль и функция гиалуроновой кислоты в суставах 27
Глава 2. Объект и методы исследования 44
Глава 3. Биофизическая характеристика структуры модифицированной гиалуроновой кислоты 52
3.1. Модификация гиалуроновой кислоты 52
3.2. Исследование реологических свойств ГКи МГК 70
3.3. Дополнительные исследования ГК и МГК 88
3.4. Исследование устойчивости водных растворов ГКи МГК 94
Глава 4. Исследование примесей в составе модифицированной гиалуроновой кислоты 113
4.1. Исследование белковых примесей 113
4.2. Исследование сульфатных групп 114
4.3. Исследование примесей металлов 116
4.4. Исследование молекулярной массы 118
4.5. Токсикологические, бактериологические и технические исследования ГКи МГК 118
Глава 5. Биологическое влияние модифицированной гиалуроновой кислоты на суставную систему 125
5.1. Системный анализ и исследования биофизической эффективности МГК при внутрисуставном введении 125
5.2. Исследование иммуномодулирующего действия гиалуроновой кислоты in vitro 136
5.3. Биологические эффекты модифицированной гиалуроновой кислоты 13 9
Заключение (выводы и практические рекомендации) 141
Список использованной литературы 144
Приложение 150
- Биологическая роль и функция гиалуроновой кислоты в суставах
- Объект и методы исследования
- Модификация гиалуроновой кислоты
- Токсикологические, бактериологические и технические исследования ГКи МГК
Введение к работе
Актуальность работы. Гиалуроновая кислота (ГК) издавна применяется в различных областях биологии и медицины, особенно в дерматологии и косметологии (Duranti F.,1998; Эр-нандес Е.И.,1998). Производство ГК налажено в таких странах, как Швеция, США и др. Как субстанция с медицинскими показателями, в России ГК начала производиться в 2000 г. в годе Туле (ФСП 42-0093-0221-00).
ГК широко применяется в виде различных косметологических форм: крема, сыворотки, геля; в виде растворов для электрофореза; в виде гидрогелей в глазной хирургии и ультразвуковой диагностике; суппозиториев в иммунологии; наружных и полостных покрытий в хирургии (Самойленко И.И.,2004).
Первоначально ГК отводилась роль наполнителя межклеточного пространства, однако развитие экспериментальных и теоретических биофизических методов исследования полимеров дало толчок к изучению ГК как природного регулятора ряда биологических процессов (миграция фибробластов и пролиферация эпителиальных клеток, стимуляция ангиогепе-за, активация компонентов гемостаза, и др.) (Suzuki М.,1995). Определена значимость ГК как одного из адаптогенов синтоксинов и эффективного, биологически активного вещества (Larsen N.E.,1998; Prestwich G.D.,2000, Корягин A.A.,2004, Наумова Э.М., 2005).
Определена значимость ГК как транспортного средства для доставки и контролируемого освобождения лекарственных средств (Хадарцев А.А.,2003); созданы методики, адаптирующие ГК к современным инструментальным способам лечения - электрофорез, лазеро-форез и ряд других (Marriot, 2005).
Задачи, поставленные клинической практикой: артрологией, травматологией и др. (Swann D.A.,1991), обусловливают необходимость создания модифицированной гиалуроно-вой кислоты (МГК), сохраняющей биосовместимость, биодеградируемость и фармакологические свойства природной ГК.
Попытки использовать ГК для внутрисуставного введения были мало результативны из-за отсутствия специальных модифицированных форм, обеспечивающих необходимые биофизические эффекты (Barbacci, 2004; Pressato, 2004).
Актуальна оценка биофизических свойств модифицированной ГК (МГК) для внутрисуставного введения и определение перспектив ее применения в медико-биологической практике с позиций системного анализа.
Цель исследования. Системный анализ и оценка биофизической характеристики модифицированной гиалуроновой кислоты, адаптированной к внутрисуставной биологической системе организма человека.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи.
-
Подтвердить получение и исследовать основные реологические, термические, спектральные свойства МГК, изучить ее устойчивость в виде водных растворов при воздействии различных физических факторов (тепловая и низкотемпературная обработки, различные рН, ионизирующая радиация) и под действием ферментов (протеаз).
-
Определить наличие примесей МГК как факторов возможных токсических и аллергических реакций различными биофизическими методами.
-
Определить молекулярные и концентрационные особенности водных растворов МГК.
-
Исследовать биологическую эффективность МГК как заменителя внутрисуставной жидкости, изучить ее системное воздействие на суставы.
Научная новизна исследования. Впервые дана биофизическая характеристика МГК и установлены молекулярные и концентрационные особенности ее водных растворов, обеспечивающие биологическую эффективность МГК как заменителя внутрисуставной жидкости.
Показано, что основным характеристическим показателем реологических свойств МГК, как аналога синовиальной жидкости, является вязкость.
Определена стабильность вязкости водных растворов МГК при воздействии различных физических факторов (тепловая и низкотемпературная обработки, различные рН, ионизирующая радиация) и ферментов (протеаз).
Установлены пороговые значения примесей в составе МГК (родственные сульфатные соединения, остаточные белки, низкомолекулярные фракции ГК, тяжелые металлы), являющихся факторами возможных аллергических и токсических реакций.
Внутрисуставное введение раствора МГК является фактором, способствующим восстановлению нарушенного гомеостаза на микро-, мини- и макроуровнях.
Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования. Результаты работы дают объяснение эффективному использованию МГК в лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата человека, позволяют успешно осуществлять модификацию ГК по предложенной схеме сшивки с дивинилсульфоном (ДВС). Наши данные вносят существенный вклад в научное обоснование применимости МГК как заменителя синовиальной жидкости, а также углубляют фундаментальное понимание роли МГК в восстановлении нарушенного гомеостаза в коленном суставе и позволяют провести системный анализ биофизических характеристик МГК как биологически активного вещества.
Результаты исследований ГК и МГК использованы при разработке и внедрении в медицинскую практику биодеградируемого протеза синовиальной жидкости, имплантируемого в коленный сустав по ТУ.9398-001 -78467549-2006 и защите патента № 2268052 (Россия). Основные положения диссертации используются в работе ГУП ТО НИИ Новых Медицинских Технологий и преподавании на кафедрах медицинского факультета ТулГУ.
Апробаиия работы. Основные результаты по теме диссертации были представлены и обсуждены на научных мероприятиях различного уровня: международные научно-практические конференции «Передовые технологии эстетической дерматологии и пластической хирургии» (Москва, 15 -16 октября 1998 г. и 22-23 июня 1999 г); Всероссийская конференция «Новые технологии в хирургии» (Москва. 11-12 марта 1998 г.); межведомственный научный семинар по проблеме ГУК на базе НИИ ЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи АМН РФ (Москва, 20.11.1997 г.); на заседании комиссии Комитета по инструментам, приборам, аппаратам и материалам, применяемым в общей хирургии МЗ РФ №29/1-1186-2001 (Москва, 21.06.2001 г.); на НТС Центрального научно-исследовательского кожно - венерологического института МЗ РФ (Москва, 21.03.2001 г.); на заседании комиссии Управления регистрации лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 03-349с/0592 (Москва, 13.10.2005 г.). Апробация работы проведена на совместном заседании кафедры медико-биологических дисциплин ТулГУ и Ученого совета ГУП ТО НИИ Новых Медицинских Технологий (Тула, 16.11.2006 г.).
Личный вклад автора заключается в постановке задачи исследования, анализе современного состояния проблемы, разработке новых и внедрении стандартных методик для системного анализа и оценки биофизической характеристики модифицированной гиалуроновой кислоты, адаптированной к внутрисуставной биологической системе организма человека, анализе полученных результатов и создании научного обоснования для применения МГК в медицинской практике.
Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликовано в 1996-2006 гг. 19 работ, в том числе 12 статей (8 в журналах, рекомендованных ВАК), 7 патентов РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на \?SCs стр., состоит из введения, пяти глав, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка использованной литературы и приложения. Работа содержит Ъ>Ъ рисунков, ^Л таблиц, список литературы содержит "V5. источников ( \Ч отечественных и ..4 зарубежных).
Биологическая роль и функция гиалуроновой кислоты в суставах
Биологическая роль ГК определяется не только ее физико-химическими свойствами, но и способностью взаимодействовать с клетками через мембранные рецепторы, влияя на их поведение [5]. Экспериментально показано [32], что клеточная пролиферация хондроцитов и синовиальных клеток ингибируется высокомолекулярной ГК, в то время как ГК с низкой молекулярной массой может быть стимулятором этих процессов. Обладая уникальной молекулярной организацией, ГК способна взаимодействовать с водой и компонентами экстрацеллюлярного матрикса, что придает особые физикохимические свойства тканям [32]. Водный баланс, механические свойства, взаимодействие и строение матрикса связаны с молекулярной структурой ГК, см. рисунок 4 [40]. В полости сустава ГК присутствует как в матриксе хряща, так и в синовиальной жидкости. Ее уникальные реологические свойства определяют вязкоупругие характеристики синовиальной жидкости, которая благодаря присутствию ГК в физиологической концентрации представляет собой идеальную смазку и амортизатор между суставными поверхностями. При воспалительном процессе в суставе деградация ГК под влиянием целого ряда факторов значительно уменьшает способность синовиальной жидкости выполнять свои функции [33]. В суставе ГК синтезируется хондроцитами в хряще и фибробластами (синовиоциты типа В) в синовии. Синтезируемая ранее ГК интегрируется в хрящевой матрикс, а ГК, синтезируемая синовиоцитами, попадает в синовиальную полость [39]. Поддержание водного баланса в системе Выполнение функции смазки Компенсация упругих ударных нагрузок Поддержание структуры матрикса Формирование объемных структур матрикса Активация компонентов гемостаза Детоксикационная функция Регуляция процессов клеточной пролиферации Участие в процессах иммунного распознавания Регуляция процессов дифференциации клеток Участие в антиоксидантных системах -29-Фундаментальная роль ГК в хряще - сохранение структуры протеогликанов, которые в связи с ГК образуют посредством протеиновых соединений макромолекулы (агреканы) с высокой молекулярной массой. Протеиновые соединения стабилизируют протеогликановые макромолекулы, откладывающиеся внутри коллагеновой сетки хряща [34]. Молекулы протеогликана в нормальном состоянии придают упругость и прочность хрящу, что позволяет ему сохранять устойчивость и механическую прочность при физической нагрузке.
В то же время гидратация протеогликановой молекулы полностью обеспечивается ГК. С возрастом в хряще, как правило, возрастает концентрация ГК, однако молекулярная масса снижается, что является следствием недостаточной протеогликановой агрегации и свидетельствует об экстрацеллюлярной поломке. Подобно этому, при артрозе ГК деполимеризируется с разрушением протеогликановых макрообразований. Молекула ГК может быть также частично разрушена специфическими энзимами или свободными радикалами. Это приводит к нарушению механических свойств ткани и в конечном счете - к выраженной дисфункции сустава. Таким образом, ГК играет важнейшую роль в обеспечении механической прочности суставного хряща у здоровых лиц и при патологии [27]. В синовиальной жидкости неизмененного сустава наблюдается высокая концентрация ГК (2 - 4 мг/мл ) с большой молекулярной массой [35].Такая комбинация обеспечивает вязкоупругие свойства с оптимальным смазывающим и отличным амортизирующим эффектом. Кроме того, ГК из синовиальной жидкости проникает в поверхностные отделы хряща, связывает его тканевой матрикс, суставной капсулы и внутрисуставных связок и заполняет пространство между клетками и коллагеновыми волокнами [35].
Высокие вязкоупругие свойства молекулы ГК в матриксе хряща обеспечивают механическую защиту клеток, включенных в него, и механическую стабилизацию сети коллагеновых волокон. Образуя на поверхности хряща защитный слой, ГК может предотвращать фрагментирование фиброзных волокон. Важным звеном в патогенезе артроза является снижение вязкоупругих свойств синовиальной жидкости, что напрямую связано с уменьшением молекулярной массы и концентрации ГК [36]. Установлено, что снижение вязкоупругих свойств синовиальной жидкости повышает чувствительность хряща к повреждению и другим воздействиям [37]. Очевидно, что вязкоупругие свойства синовиальной жидкости, зависящие от ГК, играют важную роль в функционировании сустава как в норме, так и при патологии. Внимание привлекает взаимодействие ГК с клетками синовиальной среды (синовиоцитами, хондроцитами) и с воспалительными клетками. Экспериментально показано, что введенная в полость пораженного артрозом сустава экзогенная ГК с высоким молекулярным весом стимулирует синтез синовиоцитами собственной ГК и ингибирует индуцированный IL-1 синтез PGE2 и освобождение арахидоновой кислоты синовиоцитами. На синовиоциты непораженного сустава этот препарат действия не оказывает [38]. Оказалось также, что введение в сустав ГК с низкой молекулярной массой и в низкой концентрации ингибирует синтез синовиоцитами собственной ГК.
Объект и методы исследования
ГК выработана из гребней половозрелых, птиц прошедших ветеринарную экспертизу на соответствие требованиям ТУ .9212-312-23476484-04, базовые характеристики субстанции соответствуют ФСП 42-0093-0221-00, произведена в соответствии с ТУ.9358-005-12466809-98 по патенту №2157381 РФ с приоритетом от 01.03.1999 г. и подвергшаяся модификации поперечной сшивкой с ДВС. Клинические объекты исследования
Клинические испытания 1% водных растворов МГК проведены (в соответствии с письмом Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития РФ №03-349с/0592) в трех независимых, аккредитованных на исследования новых изделий для медицины, центрах: на базе ревматологического отделения Городской клинической больницы №1 им. Н.И.Пирогова (Москва); в Российском Университете дружбы народов на базе городской клинической больницы №31 в ортопедическом отделении (Москва); в Главном военно-клиническом госпитале им. Н.Н.Бурденко на базе ортопедического отделения (Москва) по изучению эффективности и безопасности протеза синовиальной жидкости коленного сустава на основе гиалуроновой кислоты у больных с остеоартрозом.
В экспериментах по исследованию концентрационных особенностей растворов ГК и МГК использовали мышей Balb/c (весом 16-18 гр.) по программе, разработанной в специализированном медицинском учреждении. Мыши выращивались и содержались в контролируемых барьерных условиях и перед экспериментом в течение 1,5-2 недель адаптировались к стандартным условиям. ИК-спектры всех исследуемых соединений снимали на регистрирующем спектрофотометре «СПЕКОРД 75-IR» для кристаллических исходных продуктов в виде таблеток, ГК и МГК в виде тонких пленок.
Исследование реологических свойств гиалуроновой кислоты. Для определения изменений реологических свойств ГК и МГК исследовались зависимости динамической вязкости различных по концентрации, температуре, степени модификации растворов по стандартной методике в соответствии ГФ XI, вып. 1, с. 90 (ротационный метод). Измерения проводили на ротационном вискозиметре с системой коаксиальных цилиндров при различных скоростях сдвига на ротационном универсальном вискозиметре "ПОЛИМЕР-РПЭ-1М". Во всех измерениях переключатель коэффициента находился в положении 30. Переключатель скорости градуирован в значениях 1, 2, 4 и т.д. до 2048, по которым при помощи приложенной в паспорте таблицы определяется скорость сдвига. Рабочий зазор между измерительными цилиндрами заполнялся исследуемой жидкостью объёмом 10 мл при помощи медицинского шприца. Заданная температура измерения устанавливалась при помощи термостата в течение 20 минут с точностью ±0,5С. Переключатель скоростей переводится в положение, соответствующее выбранной скорости сдвига. При помощи кнопки «ротор» включается вращение внутреннего цилиндра и фиксируются показания цифрового индикатора.
Полученные экспериментальные данные аппроксимированы реологическим уравнением состояния, которое представляет собой степенную функцию вида: где щ - наибольшая ньютоновская вязкость; кип- эмпирические постоянные. Предложенное уравнение позволяет произвести теоретический расчет вязкости раствора известного состава при различных скоростях сдвига и температурах,
Термический анализ ГК и МГК проведен на дериватографе Q-1500D фирмы "MOM", в воздушной среде, в диапазоне температур от +2 до +41 С по стандартной методике. Скорость нагрева (охлаждения) варьировалась от 0,6 до 7,0 К/мин. УФ-спектрометрия водных растворов ГК и МГК проводилась на спектрофотометре СФ-103, с диапазоном измерений 190-1100 нм, шириной выделяемого спектрального интервала 5 нм по стандартной методике.
Исследования фотоэлектрическим методом количественного содержания ГК в растворах по глюкозамину проведено по стандартной методике на 1% растворах МГК (в соответствии с ФСП 42-0093-0221-00).
Исследование прозрачности 1% водных растворов базовой субстанции и модифицированной гиалуроновой кислоты проводили по ГФ XI, вып.1, с. 198. Высчитывался коэффициент пропускания электромагнитного излучения (ЭМИ) для 1% водного раствора препарата ГК и МГК относительно дистиллированной воды. Измерения проводились с помощью КФК в стандартной кювете 10 мм на длине волны 610 нм. Прозрачность раствора является важной характеристикой полимера и определяется как величина коэффициента пропускания ЭМИ в световом диапазоне раствора полимера относительно воды.
Коэффициент пропускания ЭМИ раствора полимера зависит от его способности поглощать или рассеивать поток монохроматического света, что, в свою очередь, определяется строением молекул полимера, его концентрацией и наличием в растворе примесей побочных веществ.
Модификация гиалуроновой кислоты
Модификация ГК придает ей хорошие реологические и вязкоупругие свойства, а также увеличенное сопротивление деградации под действием ферментов. Подобное изменение свойств ГК расширяет круг ее применения в качестве основного компонента различных препаратов и лекарственных средств. Модифицированная ГК может использоваться как носитель для широкого ряда освобождаемых биологически активных веществ, имеющих лечебное или терапевтическое значение для человека или животных, для предупреждении образования послеоперационной спайки или срастания тканей тела во время послеоперационного периода, а также для внутрикожных имплантаций и косметических инъекций для мягкого увеличения ткани.
Ковалентная модификация ГК обычно проводится по какой-либо из двух функциональных групп: карбоксильных или гидроксильных см. рис. 5.
Модификация ГК по карбоксильным функциональным группам может проводиться этерификацией [61,62] или использованием карбодиимид-опосредованных реакций [63,64,65].
Модификация ГК по гидроксильным функциональным группам может проводиться следующими способами: сульфирование [66], эстерификация [64], присоединение изомочевины [64] и периодатные (йоднокислые) окисления. Также возможна модификация редуцирующего конца через восстановительное аминирование [64]; амидные модификации естественно деацилированных глюкозаминовых единиц, содержащихся в структуре ГК методом гидразинолиза [64].
Модификация ГК перечисленными выше методами позволяет осуществить процесс перекрестного сшивания, этот процесс представляет собой преобразование всей реакционной массы ГК путем образования поперечных связей между линейными молекулами полимера, результатом такого воздействия является образование трехмерной молекулярной сетки, обладающей иными реологическими и биологическими свойствами. То есть, исходный раствор ГК преобразуется в механически устойчивый материал, обладающий необходимыми физико-химическими характеристиками. Для изменения физических характеристик ГК также используют методы поверхностной иммобилизации.
Разработано множество способов перекрестного сшивания модифицированной ГК, например перекрестное сшивание бис-эпоксидом [67] и варианты дивинилсульфоном [64,68]; внутренняя этерификация, фотоперекрестное сшивание [64], перекрестное сшивание глутаровым альдегидом, бискарбодиимидом [64,12]; гидразидом [7]; перекрестное сшивание с остаточными белками [69].
Среди множества способов модификации нами были отобраны два наиболее щадящих метода, позволяющих добиться изменения реологических свойств материала, не разрушая его: перекрестное сшивание дивинилсульфоном и химическая модификация карбоксильных групп адипиновым дигидразидом (карбодиимидный способ) с последующей перекрестной сшивкой с помощью диметилсуберимидата.
Карбодиимидный метод является одним из мягких методов активации карбоксильных групп лабильных биологических препаратов. Химическая модификация карбоксильных функциональных групп ПС карбодиимидными составами осуществляется в воде при комнатной температуре и рН 4,75. Для получения гидразид-модифицированной ГКбыл использован адипиновый дигидразид.
Активация гиалуроновой кислоты проводилась с использованием 1 циклогексил-3 -(2-морфолиноэтил)карбодиимид 4-толуолсульфоната.
Модификация ПС протекает по следующей схеме: Гидразид-модифицированная ГК может быть в дальнейшем перекрестно сшита с помощью различных агентов [61,65]. В работе был использован диметил суберимидат как бифункциональный перекрестосшивающий агент. Это соединение представляет собой этерифицированный дигидразид октандионовой кислоты - гомолога дигидразида адипиновой кислоты. Перекрестное сшивание гидразид-функционализированной ГК происходит по схеме:
Различная степень перекрестного сшивания, регулируемая количеством добавленного перекрестно-сшивающего агента, позволяет получить гели с различными реологическими свойствами. Результатом проведенных нами экспериментов стало получение образца модифицированной ГК, обладающего необходимыми физико-химическими характеристиками.
Подтверждение сшивки методом ИК-спетроскопии Для подтверждения сшивки гиалуроновой кислоты были сопоставлены ИК-спектры исходной и модифицированной ГК в виде тонких пленок, полученных испарением водных растворов ГК в разных условиях. Сравнением спектров модифицированной ГК со спектрами исходной ГК и компонентов, используемых для модификации, было установлено, что в структуру модифицированной ГК не входит карбодиимид, так как в спектре ГК модифицированной отсутствует полоса карбодиимидной группировки v{N=C-N) при 2120 см"1. В ИК-спектре исходной ГК наблюдаются полосы, соответствующие всем ее основным структурным элементам:
Токсикологические, бактериологические и технические исследования ГКи МГК
Касаткина, д. 3. Заказчик исследований ООО HI 111 «Тульская индустрия ЛТД». По результатам исследований (протоколы исследований представлены в приложении) сделано заключение: протез синовиальной жидкости АРТРОНИЛ нетоксичен, стерилен, отвечает требованиям, предъявляемым к медицинским изделиям, длительно контактирующим с внутренней средой организма. Технические исследования по испытанию образцов, предназначенных для введения внутрь сустава человека на основе МГК в форме изделия медицинского назначения (готовые формы изделий показаны на рис. 32 и рис. 33) с торговой маркой АРТРОНИЛ, проведены по заявленным характеристикам в сравнении с зарубежными аналогами в испытательном центре медицинских изделий ФГУ ВНИИИМТИЦМИ по заказу 000 НИН «Тульская индустрия ЛТД». В результате проведенных исследований (программа исследования и протокол испытаний приведены в приложении) утановлено, что гель на основе 1,0% водного раствора гиалуроната натрия (натриевой соли ГК) соответствует требованиям ГОСТ Р 50444-92. Общие результаты исследования примесей в конечном продукте представлены в табл.20. Из полученных результатов (табл. 20), а также приведенных результатов токсикологических, бактериологических и технических исследований можно сделать вывод о достигнутом необходимом уровне безопасности готовых изделий на основе МГК, а также исключения любых отрицательных реакций организма человека при введения 1% водного раствора МГК внутрь сустава в качестве заменителя синовиальной жидкости. В соответствии с письмом Федеральной Службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № 03-349с / 0592 от 13.10.2005г. за период с 01.02.2006 по 10.10.2006 проведен цикл интегральных системных исследований по изучению эффективности и безопасности изделия на основе МГК с торговой маркой АРТРОНИЛ: В Российском Университете дружбы народов на базе городской клинической больницы № 31 в ортопедическом отделении были проведены клинические исследования изделия медицинского назначения «Протез синовиальной жидкости с торговой маркой АРТРОНИЛ по сравнению с изделием на основе ГК - СИНВИСК(производства США). Изучалась клиническая эффективность и переносимость изделия на основе МГК при использовании для внутрисуставных введений у больных с остеоартрозом коленного сустава.
Наблюдалось 16 больных. Критерии включения в группу наблюдения -достоверность диагноза «остеоартроз (ОА) коленного сустава», подкрепленного наличием клинических симптомов и рентгенологических признаков ОА. Обязательным условием было наличие одного из трех рентгенологических признаков ОА: формирование костного шипа, сужение суставной щели, субхондральный остеосклероз. Из группы испытуемых исключались: больные с выраженным сужением суставной щели, наличием значительного выпота в полости сустава, а также получавшие в течение 2 недель до начала исследования внутрисуставные инъекции лекарственных препаратов; больные с тяжелыми сопутствующими заболеваниями печени, почек, системы кроветворения, беременные и кормящие женщины, а также страдающие лекарственной аллергией.
На период исследования больные не должны были применять противовоспалительные и другие подобные им препараты. Исключались также внутрисуставные введения других лекарственных средств и назначение физиотерапевтического лечения.
Диагноз основывался на выявлении таких характерных клинических признаков ОА, как боль, припухлость, ограничение подвижности сустава, а также типичной рентгенологической картины: сужение суставной щели и вторичные изменения костей со склерозированием, появлением остеофитов и образованием субхондральных кист.
В соответствии с поставленными задачами разработанная программа исследования включала определенный набор клинических и инструментальных методов. Для унифицированной характеристики боли в коленном суставе использована сенсорно-аналоговая шкала; оценка припухлости и подвижности сустава выполнялась с применением визуально-аналоговой шкалы. Для оценки болевого синдрома учитывались следующие показатели: боль в покое, боль при ходьбе, боль при подъеме и спуске, при сгибании и разгибании сустава, боль при надавливании, стартовая боль. Для характеристики воспалительного поражения коленных суставов оценивалась припухлость коленных суставов, баллотирование надколенника, наличие или отсутствие синовиального выпота и его объём, а также объём возможных движений (сгибание и разгибание).