Введение к работе
Введение. Актуальность проблемы.
Структура и физические свойства фибриллярных
макромолекул - важнейшая проблема современной
молекулярной биофизики. Прежде всего это определяется тем, что современная биофизика последовательно продвигается в область анализа молекулярных механизмов клеточных и тканевых явлений, а они в значительной степени связаны с функционированием и структурными перестройками фибриллярных биополимеров, важнейшими из которых являются коллагены различных типов. Коллаген - основной белок соединительной ткани. Его содержание составляет около восьмидесяти процентов всех белков организма. В настоящее время известно до четырнадцати структурно-функциональных типов коллагена, описана биохимия компартментов с участием каждого из молекулярных типов, четко дифференцированы механизмы их биологического действия, показана важность коллагенов для осуществления дифференцнровки и роста тканей, а также в ряде процессов регуляции мембранной активности. Важная роль коллагенов в организме определила и большой фронт работ, связанных с изучением биосинтеза коллагенов, процессов их структурообразования и фибриллогенеза. Тем не менее, несмотря на огромное количество работ, посвященных анализу структур коллагенов на различных уровнях их организации, - от анализа периодичностей в последовательностях до проблем фибриллогенеза "и трехмерной структуры волокон, мы до сих пор не знаем ни законов построения трехмерной структуры фибрилл для какого бы то ни было из типов коллагенов, ни детальных характеристик периодичностей, встречающихся в них. Вместе с тем незнание принципов строения белка ни на макромолекулярном, ни на на уровне фибрилл затормаживает все исследования, связанные с анализом биологических функции коллагена
Что же затрудняет решение структурной проблемы ЭТОГО важнейшего системного белка, исследования которого насчитывают уже не один десяток лет? Что в первую очередь остается неясным? Это прежде всего - физические причины, определяющие структурные механизмы фибриллогенеза. Имеется ввиду вопрос: существующая структура фибриллы образуется вследствие специфических взаимодействий между боковыми радикалами макромолекулы как, например, электростатических , или фибриллогенез - это типичный процесс кристаллизации с зародышеобразованием и последующим ростом кристаллической фазы. В этом втором случае геометрия распределения зарядов вдоль макромолекул коллагенов разных типов должна, по крайней, мере быть в согласии с геометрией элементарной ячейки формирующегося кристалла.
Вместе с тем точное установление роли последовательности аминокислот в процессах структурообразования трехцепных молекул и их дальнейшего участия в фибриллогенезе наталкивается на целый ряд трудностей. Хорошо известно, что последовательность аминокислот в коллагенах отличается крайне точной периодичностью на различных масштабах длин. Однако неизвестно, какие из наблюдаемых периодичностей возникают как следствие дубликации более примитивных генов, а какие возникли в результате отбора, происходящего вследствие элиминации неудачных вариантов пространственных структур макромолекул и фибрилл.
Для решения указанной альтенатавы требуется развитие адекватных методов анализа корреляций в последовательностях символов и в качестве предельного их отражения периодичностей в расположении аминокислот.
Важнейшей задачей на пути построения реальной физической модели фибриллогенеза мы считаем установление периодичностей в аминокислотных последовательностях различных коллагенов. Исследование распределения зарядов в пространстве фибриллярных макромолекул эквивалентно исследованию распределения аминокислот вдоль полипептидной цепи молекулы, поскольку эта цепь расположена в целом параллельно волокну. Именно поэтому закономерности в
распределении аминокислот в фибриллярных макромолекулах
лежат в основе процессов организации вторичных структур в их
полипетидных цепях , самосборки и функционирования волокон.
Установление периодичностей в распределении аминокислот в
молекуле важно прежде всего потому, что коллаген является
основой дифференцировки важнейших тканей организма. Детали
распределения физических свойств в пространственной
структуре волокон могут быть причиной разнообразия
физических механизмов дифференцировки и
структурообразования тканей разного типа.
К сожалению, существовавшие до сих пор методы анализа
периодичностей оказались несовершенными для детального
анализа тех корреляций, которые отражают такие
периодичности в расположении аминокислот, которые или ограничены незначительной длиной по цепи или существуют по всей молекуле, но повторение их не является точным.
Поэтому для решения физических проблем фибриллогенеза
коллагенов прежде всего актуальна задача разработки новых
методов анализа распределения символов в их первичной
структуре. Решение этой задачи не менее актуально также и
для анализа первичных структур самых различных
биополимеров. Действительно, основному множеству
биополимеров не свойственны точные периодичности в
распределении химических символов вдоль их
макромолекулярных цепей, а количество повторяющихся единиц часто бывает даже меньшим, чем в коллагенах.
Цель и задачи исследования.
1. Анализ распределения физико-химических характеристик вдоль волокон коллагена, таких как электростатический потенциал, индекс гидрофобности, а также распределения вдоль волокна групп с характерными физико-химическими свойствами как основы понимания молекулярного механизма функционирования соединительной ткани и процессов дифференцировки .
2.Разработка нового эффективного метода анализа
последовательностей в биополимерах, а именно, символьного
дискретного Фурье-анализа.
З.Применение разработанного метода к анализу
последовательностей в коллагенах различного происхождения.
4.Исследование периодичностей в коллагенах в генетическом и
структурно-функциональном аспектах.
5. Разработка модели начальных этапов фибриллогенеза
коллагена
Научная новизна работы.
Построен непротиворечивый математический метод Фурье-анализа символьных последовательностей конечной длины. Это впервые дает возможность сравнивать периодическую структуру последовательностей, написанных в различных алфавитах, включая ДНК и белки. Подчеркнем, что разработанная процедура впервые дает возможность адекватного и непротиворечивого представления любых характеристик по существу любой наперед заданной последовательности любых символов в виде цифрового материала, пригодного для корреляционного и Фурье-анализа. Наконец, предложенный метод дает возможность изучать периодичности в последовательностях на фоне абсолютных повторов, а также обнаруживать периодичности, существующие на расстояниях, сравнимых с полной длиной последовательности символов .
Метод применен для исследования периодичностей в
последовательностях аминокислот в коллагене I крысы и
коллагенах из различных в таксономическом отношении
организмов. В результате обнаружены как новые
периодичности в распределении конкретных аминокислот, так и
установлено, какие семейства амшюкислот(с определенными
физико-химическими свойствами), ответственны за
периодичности, наблюдавшиеся ранее в различных экспериментах и расчетах.
Впервые в коллагене I найден период, соответствующий 72 остаткам. Он укладывается целое число раз на трехцепном участке макромолекулы коллагена и кратен ее длине.
Установлено, что найденный период соответствует распределению заряженных групп, причем суммарному; распределение положительных и отрицательных зарядов по отдельности таково, что ионные пары между трехцепными макромолекулами могут завязываться на их концах, причем только по принципу; голова к хвосту, т.е. первый период с последним. На основании этого результата построена новая модель фибриллы коллагена, удовлетворяющая существующим физико-химическим и дифракционным данным. Модель показывает также, что фибриллогенез коллагена происходит по механизму зародышеобразования и последующего роста кристаллической фазы.
Анализ свойств наблюдаемых периодичностей позволил установить ряд новых закономерностей в распределении аминокислот в полипептидных цепях коллагенов.. Так показано, что заряды разного знака распределены согласно одинаковым периодичностям и разнесены вдоль фибриллярной макромолекулы. Это, по-видимому, означает, что ионные пары играют важную роль не только в упаковке трехцепных молекул в волокно, но также и в стабилизации самой трехцепной макромолекулы, а также во встраивании волокон в ткань. Остающиеся несбалансированные заряды, видимо, определяют взаимодействие с межклеточными белками и, таким образом, в конечном счете к дифференцировку клеток.
Сравнительный анализ периодичностей распределения аминокислот в коллагенах различных типов из разных животных позволил установить одинаковый для всех коллагенов период, свойственный распределению аминокислот любого типа. Им оказался период, соответствующий 39 аминокислотам. Этот период наблюдается также и для участков цепи со скоплениями аминокислот. Можно думать, что происхождение указанной периодичности обязано своим возникновением одной из двух причин - либо этот период определяет истинный период левой спирали трехцепной молекулы коллагена, либо является главной периодичностью, определяющей фибриллярность макромолекулы.
Все наблюдаемые периодичности разделены на основные, которые возникают вследствие повторения конкретных
аминокислот или определяемых ими групп свойств, и производные, которые возникают как следствие суперпозиции основных периодов. Продемонстрировано, что период повторяемости, соответствующий 234 аминокислотам, возникает как суперпозиция периодов 18, 26, 39, 47, 78.
Установлена связь между периодичностями в распределении
аминокислот и их кодонов. Показано по третьему нуклеотиду,
кодирующему глицик, наличие периода 702 нуклеотида, что
соответствует 234 аминокислотам. Этим доказано, что период в
234 аминокислоты, считавшийся главным
структурообразующим, имеет генетическое происхождение, а не связан с отбором по структурному признаку. На основе новых данных критически разобраны все до сих пор предложенные модели структурной организации фибрилл коллагенов и показано преимущество разработанной нами новой модели.
Практическое значение работы.
Полученные результаты могут быть использованы при анализе последовательностей нуклеотидов, а также генов в геномах, аминокислот в белках; для программ типа Геном человека, биоинженерия и т.п. Созданные программы могут быть включены в пакеты программ анализа биополимеров для биотехнологии и биомедицины. Возможен Фурье-анализ лингвистических текстов, т. е. применение разработанного метода в различных областях структурной лингвистики.
Аппробация.
Результаты диссертации докладывались на Международной
конференции "Современные проблемы биофизики",
Международном симпозиуме "Молекулярная биология на рубеже XXI века", а также на ряде всероссийских симпозиумов и конференций.
Публикации.
По материалам работы опубликованы четыре статьи и тезисы.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 90 страницах и включает 22 рисунка и 3 таблицы. Список литературы содержит 112 наименований. Диссертация состоит из введения и пяти глав.