Анализ фото- и термоиндуцированных структурно-функциональных изменений супероксиддисмутазы и каталазы Башарина, Ольга Владимировна

Введение к работе

Актуальность проблемы.

Изучение закономерностей действия физико-химических факторов на биологические системы различного уровня организации является одной из центральных проблем биофизики, биохимии и молекулярной биологии.

Супероксиддисмутаза (К.Ф.1.15.1.11) и каталаза (К.Ф.1.11.1.6) представляют собой специфические антиоксидантные ферменты. Супероксиддисмутаза (СОД) осуществляет в клетках аэробных организмов функцию регуляции уровня супероксидных анион-радикалов кислорода, каталаза является синергистом СОД в клетке, разрушая продукт супероксид-дисмутазной реакции - пероксид водорода. Выяснению структуры и механизмов функционирования супероксиддисмутазы и каталазы посвящено значительное количество работ (C.Tanford et al., 1962; J. McCord, LFrldovich, 1969; B.Keele et al., 1971; Б. К.Саундерс, 1978; Н.В.Гуляева и соавт., 1989).

УФ-свет и температура являются естественными экологическими факторами, постоянно действующими на биосистемы. Возросший в последнее время интерес к исследованию биологического действия УФ-излуче-ния связан с проблемами нарушения целостности озонового елся вследствие производственной деятельности человека. Актуальность проблемы диктует необходимость глубокого и целенаправленного изучения биологических эффектов действия УФ-света на молекулярном уровне для выяснения ключевых механизмов, лекащих в основе его деструктивного, мутагенного, а также лечебного и профилактического действия на живые организмы.

Однако, на наш взгляд, совершенно недостаточно раскрыты вопросы о взаимосвязи между структурными превращениями молекул СОД и каталазы и проявлением их каталитической активности при модификации такими факторами среды, как УФ-свет и температура.

Адаптация к изменяющимся условиям внешней среды обеспечивает самосохранение и самосодержание живой системы. Однако молекулярные механизмы адаптации, лежащие в основе макробиологических эффектов, во многом остаются нерешенными. Именно белковым системам принадлежит ведущая роль в регуляции функционирования организмов. Изучение адаптивных процессов на биофизическом и биохимическом уровнях позволит выявить наиболее общие закономерности функционирования биосистем.

Решение указанной проблемы имеет важное значение для медицины. В настоящее время в хирургических, акушерско-гинекологических и те-

рапевтических клиниках используется метод аутотрансфузии УФ-облучен-ной крови (АУФОК) (К.А.Самойлова, И.Г.Дуткевич, 1986; В.Е.Холмогоров и соавт., 1988; И. И. Жуликова, 1992), но молекулярные механизмы его действия раскрыты еще не полностью, что ограничивет применение этого метода при терапии ряда заболеваний. В связи с этим представлялось важным проанализировать изменение активности одного из основных ферментов антиоксидантной системы организма - СОД - после проведения АУФОК.

В литературе имеется большое количество данных о локализации отдельных ферментов и ферментных систем в клетке (F.M.Clarke, С-. J. Masters, 1973; Б.И.Курганов, 1986; П.Фридрих. 1986; Г.Л.Ермаков, 1993). Изучение ферментов без учета их взаимодействия с различными субклеточными структурами и, в частности, с мембранами, не позволяет всесторонне исследовать возможные механизмы регуляции их активности. Плазматическая мембрана включает в себя системы, ответственные за течение процессов свободно-радикального окисления, поэтому естественно предположить, что ферменты антиоксидантной системы In vivo могут находится в комплексе с мембранами.

Исходя из вышеизложенного, нами проведены комплексные исследования структурно-функциональных свойств супероксиддисмутазы и ката-лазы, модифицированных воздействием УФ-света и темпратуры в условиях различного микроокружения.

Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы явилось изучение взаимосвязи между структурными изменениями, возникающими при действии УФ-света и температуры в различных условиях микроокружения в молекулах супероксид-дисмутазы и каталазы, с проявлением их молекулами функциональной активности.

Задачи работы предусматривали:

1. Исследование воздействия УФ-излучения (240-390 км) в диапазоне доз (1,5-45,3)-10² Дж/м² на функциональные и некоторые физико-химические свойства супероксиддисмутазы.

2. Изучение влияния температуры в интервале 20*80 С на структурно-функциональные свойства супероксиддисмутазы и каталазы с целью выявления сущности процессов термоденатурации молекул этих ферментов.

3. Изучение природы взаимодействия и возможной локализации- супероксиддисмутазы на эритроцитарной мембране.

4. Исследование ферментативной активности супероксиддисмутазы и каталазы в комплексе с эритроцитарными мембранами и их компонентами.

5. Исследование фотопротекторных свойств СОД и каталазы по отношению к эритроцитарной клетке.

Научная новизна.

Работа является комплексным исследованием, посвященным анализу взаимосвязи между структурным состоянием и каталитической активностью супероксиддисмутазы и каталазы. Впервые изучено влияние УФ-света на структурно-функциональные свойства СОД, выявлен эффект ее фотоактивации при действии определенных доз УФ-излучения.

Установлено, что тепловая денатурация супероксиддисмутазы и каталазы является сложным процессом, протекающим в несколько последовательных стадий, которым соответствует определенное структурное состояние белковой молекулы. Изучены кинетические закономерности термоинактивации макромолекул указаных ферментов.

Показано, что взаимодействие супероксиддисмутазы с эритроцитарной мембраной носит электростатический характер. Обнаружено, что локализация супероксиддисмутазы и каталазы на эритроцитарной мембране сопровождается повышением их функциональной активности.

Разработаны схемы УФ- и термоиндуцированных превращений молекул супероксиддисмутазы и схема процессов термоденатурации молекул каталазы.

Практическая значимость.

Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления об особенностях фотохимических превращений субъединичных белков.

Фото- и термоиндуцированные перестройки СОД и каталазы ' необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизма адаптации живых систем к действию данных экологических факторов.

Предложенная схема реакций, приводящих к повышению активности супероксиддисмутазы, может быть полезна для понимания молекулярных процессов, лежащих в основе лечебного эффекта метода АУФОК.

Эксперименты с участием ферментов-фотопротекторов позволяют разработать основы защиты эритроцитарных клеток от повреждающего действия УФ-излучения.

- 6.-

Полученные результаты следует принимать во внимание при решении вопросов, связанных с локализацией в клетке отдельных ферментов и ферментных систем. Обратимая адсорбция ферментов на структурных компонентах клеток является одним из механизмов изменения их активности, что может быть использовано для регуляции процессов клеточного метаболизма.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной конференции "Молекулярные и клеточные основы кислотно-основного и температурного гомеостаза" (Сыктывкар,1991); VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991); IX Украинской школе-семинаре "Спектроскопия молекул и кристаллов" (Харьков, 1993); Межреспубликанских научно-практических конференциях "Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем малых рек" (Краснодар, 1992) и "Актуальные вопросы экологии и охраны природы степных экосистем и сопредельных территорий" (Краснодар, 1994); Научных сессиях Воронежского госуниверситета (Воронеж, 1990, 1994, 1995).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 7 тезисов.

На зашиту выносятся следующие положения:

1. Эффект УФ-активации супероксиддисмутазы при действии УФ-из-лучения в интервале доз (4,5-15,1)-10² Дж/м² является результатом процессов разворачивания белковой глобулы. Фоточувствительность СОД определяется структурным состоянием молекулы фермента.

2. Необратимой тепловой денатурации молекул супероксиддисмутазы и каталазы предшествуют обратимые конформационные изменения, характеризующиеся последовательным сворачиванием и разворачиванием белковых молекул.

3. Взаимодействие супероксиддисмутазы с эритроцитарными мембранами носит электростатический характер.

4. Ассоциация супероксиддисмутазы и каталазы с эритроцитарными мембранами и их компонентами при значениях рН среды 5,0 и 7,4 приводит к повышению функциональной активности изучаемых ферментов.

' 5. Схемы УФ- и термопревращений супероксиддисмутазы, термоденатурации молекул каталазы.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа включает/«^страниц машинописного текста, J^S таблиц, w рисунков. Состоит из введения, семи глав, заключения и выводов. Список литературы содержит/^«2~*работ, из них ^отечественных и4⁷ зарубежных.