Активация сигнальных процессов в клетках под действием лектинов Тимошенко, Александр Викентьевич

Введение к работе

Актуальность темы диссертации. К настоящему времени стало ясно, что кроме общеизвестной функции обеспечения клетки энергией углеводы участвуют в процессах обмена и переноса биологической информации [Laine, 1997]. Углеводные структуры различной степени сложности экспрессированы на поверхности клеток и являются составной частью клеточных рецепторных систем, участвующих в процессах молекулярного узнавания и трансмембранной сигнализации [Gabius, 1991; Rosales, Juliano, 1995; Wahl et al., 1996; Villalobo et al., 1997]. Декодирование биологической информации, содержащейся в структуре углеводных цепей, осуществляется с участием углеводсвязывающих белков (УСБ), обеспечивающих реализацию адекватного биологического ответа. Различают несколько групп УСБ, которые могут быть иммуноглобулинами (антитела против углеводных детерминант) [Feizl, Childs, 1987], ферментами (гпикозилтрансферазы и гликозидазы) [Ichikawa et al., 1992] и пектинами [Луцик и др., 1981]. К пектинам относят белки неиммунной природы, обладающие свойством обратимо и избирательно связывать углеводы и углеводные компоненты различных типов гликоконьюгатов без изменения их химической структуры. .Пектины получили широкое применение в биологии и медицине в качестве, прежде всего, гистохимических маркеров для изучения экспрессии гликолигандов на поверхности клеток и а биологических жидкостях [Луцик и др., 1989; Лахтин, 1995], митогенов [Borrebaeck, Carlsson, 1989], а также аффинных сорбентов для выделения гликопротеинов [Луцик и др., 1981] и клеточных субпопуляций [Koren, Agrov, 1985].

Исследования биологической активности пектинов, которые ранее традиционно относили к белкам растительного происхождения, существенно интенсифицировались в последние годы в связи с двумя основными достижениями в области лектинологии. Во-первых, выявлена фармакологическая значимость пектинов в качестве активных компонентов лекарственных экстрактов растений в применении к проблеме лечения рака, что относится, прежде всего, к галактозидспецифичному пектину омелы белой (Viscum album L. agglutinin, VAA) [Gabius et al., 1994]. Во-вторых, выявлены многочисленные типы УСБ в тканях, биологических жидкостях и на поверхности клеток человека и животных [Drickamer, Taylor, 1993; Barondes et al., 1994; Powell, Varki, 1995], содержание которых в организме изменяется при патологии [Gearing, Newman, 1993]. Основные научные проблемы, которые возникли в связи с этими открытиями и до сих пор не решены, состоят в установлении мембранных механизмов действия пектинов на клетки, определении физиологических функций пектинов в организме и сопоставлении биологической активности эндогенных и лекарственных пектинов.

В последние годы появились свидетельства того, что пектины обладают свойствами модификаторов биологического ответа (biological response modifiers), подобных иммуно-тропным веществам и цитокинам [Winner, 1991; Gabius et al., 1992]. В сложной цепи сигнальных реакций, которые запускаются в клетках стимулирующими факторами, можно выделить отдельные звенья, связанные с образованием и/или высвобождением таких низко-

молекулярных вторичных мессенджеров как ионы Са²*, супероксидный анион-радикал, Н2О2, монооксид азота, метаболиты арахидоновой кислоты (АК) и др. Однако данные аспекты процессов сигнализации в клетках, обусловленные действием эндогенных пектинов человека и животных, а также пектинов лекарственных препаратов растительного происхождения, остаются практически не исследованными. В то же время физиологическая значимость пектинов подтверждается данными об участии этих веществ в процессах активации комплемента [Holmskov et al., 1994], адгезии и миграции лейкоцитов [Mackay, Imhof, 1993], лектинофагоцитоза [Sharon, 1987], метастазирования [Raz, Lotan, 1987], апоптоза [Savill et al., 1993]. Несмотря на это, целенаправленное применение пектинов, кроме митогенных агглютининов Canavalia ensiformis (Con А) и Phaseolus vulgaris (РНА), в качестве стимуляторов специфических функций и реакций клеток остается ограниченным.

Таким образом, актуальность темы диссертации обусловлена необходимостью определения роли и места лекарственных и эндогенных пектинов в качестве селективных стимуляторов клеточного ответа и процессов сигнализации в клетках.

Связь работы с крупными научными программами и темами. Работа выполнялась в рамках научно-исследовательских проектов, которые финансировались Министерством образования Республики Беларусь и международными фондами: "Взаимодействия лектин-гликолиганд как новый вид молекулярного узнавания в регуляции клеточных функций" (№ г/р 19943145), "Исследование свойств и биологической активности новых классов синтетических и природных соединений в клеточных системах: эндогенные углевод-связывающие белки и неогликоконьюгаты" (№ г/р 19963652), "Выделение и клеточно-биологическая характеристика лектинов для биомедицинского применения" (Volkswagen-Stiftung, I/68 661, ФРГ), "Неогликоконьюгаты как прогностические маркеры опухолей - синтез, гистопатопогиче-ское применение и кпеточно-биологические эффекты" (INTAS-94-0289, ЕС).

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в определении биологической активности и физиологической роли растительных, эндогенных (животных и человека) и бактериальных пектинов на основе анализа механизмов ранних стадий процессов трансмембранной сигнализации в клетках иммунной системы. Основные задачи настоящей работы, решение которых было необходимо для достижения поставленной цели, состояли в следующем:

1. Исследовать молекулярно-мембранные механизмы активирующего действия га-лактозидспецифического пектина омепы белой и его субъединиц на клетки крови человека и тимоциты крыс.

2. Разработать критерии отбора растительных пектинов для биомедицинского применения на основе изучения ранних клеточных ответов (агрегация клеток, генерация активных форм кислорода, дегрануляция, модификация потоков ионов Са²⁺ и Н*).

3. Изучить влияние высокоселективных ингибиторов биосигнальных путей на устойчивость межклеточных контактов, образованных под действием пектинов.

4. Исследовать эффекторные свойства набора высокоочищенных эндогенных УСБ животных и человека, включавших три галактозидспецифичных белка (галектина) из ткани сердца быка (BL-14, 14 кДа), кишечника цыплят (CL-14, 14 кДа), печени цыплят (CL-16, 16 кДа), две субфракции IgG, различающиеся сродством к a-gal (a-gal-IgG) и p-gal (p-gal-IgG) и два пентраксина (С-реактивный белок - CRP и сывороточный амилоидный Р компонент - SAP).

5. Изучить лектинзависимую реактивность различных субпопуляций клеток экспонированных к контролируемым физико-химическим воздействиям (тепловой шок, УФ-облучение, ингибиторы протеолиза, сульфгидрильные реагенты), которые избирательно модифицируют рецепторный аппарат и инактивируют медиаторные системы клеток.

6. Определить роль лектин-гликолигандного узнавания в механизмах взаимо
действия бактерий Escherichia со// (E.coli) с нейтрофилами человека и тимоцитами крыс.

7. Экспериментально обосновать возможность использования пектинов в качестве
стимуляторов клеточного ответа в биомедицинских исследованиях и разработать пектино
вые тесты для выявления нарушений функциональной активности лейкоцитов при раковых
заболеваниях различной этиологии.

Научная новизна полученных результатов заключается в обосновании и разработке концепции об универсальной регуляторной роли углеводспецифических взаимодействий в процессах клеточной сигнализации.

Доказано, что механизм ранних стадий активирующего действия на различные типы клеток крови человека (нейтрофилы, лимфоциты, тромбоциты) и тимоцитов крыс галакто-зидспецифического пектина омелы обусловлен наличием в его составе нетоксической уг-леводсвязывающей В-субъединицы.

Впервые проведено изучение лактозоиндуцированной дезагрегации тимоцитов крыс и неитрофилов человека и показано, что специфические ингибиторы отдельных сигнальных реакций в клетках подавляют образование пактозорезистентных межклеточных контактов при действии VAA.

Обнаружено свойство растительных пектинов активировать менадионзависимуга генерацию Н₂0₂ внутриклеточными редокс-системами тимоцитов.

Показано, что агрегационная активность растительных лектинов Con A, Sambucus nigra (SNA), Solanum Tuberosum (STA), PHA, Pisum sativum (PSA), Triticum vulgaris (wheat germ agglutinin, WGA) и Urtica dioica (UDA) с различной углеводной специфичностью не является достаточным условием для запуска процессов сигнализации как в нейтрофипах человека, так и в тимоцитах крыс. Методической основой и критерием отбора лектинов лекарственных растений для биомедицинского применения является наличие у них стимулирующего действия на сигнальные реакции в клетках, связанные с такими вторичными мес-сенджерами клеточного ответа как Н₂0₂, ионы Са²⁺ и Н*.

Выявлен эндогенный галектин животного происхождения (CL-16), который in vitro был стимулятором НАДФН-оксидазной активности и дегрануляции неитрофилов человека,

а также вызывал увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca^2f ([Са²⁺],) и продукцию ионов Н⁺ в тимоцитах крыс, т.е. обладал спектром функциональной активности VAA.

Обнаружен общий момент в механизмах агрегации клеток под действием пектинов и сульфатированных полисахаридов (ПСХ), который состоит в том, что эти процессы находятся под контролем протеолитических систем клеток и высокочувствительны к действию сульфгидрильных реагентов.

Установлено, что в условиях теплового шока (45С) инициируется процесс шеддинга мембранных компонентов клеток, приводящий к сложной динамике изменения агрегацион-ных свойств клеток в ответ на действие агрегантов различной природы.

Показано, что генерация Н₂Ог нейтрофилами человека под действием пектинов с различной углеводной специфичностью (VAA, РНА и WGA) полностью блокируется в условиях краткосрочного воздействия теплового шока (46С) или УФ-облучения (254 нм); молекулярный механизм данных эффектов состоит в инактивации термолабильного цитоплаз-матического компонента НАДФН-оксидазы - р67-рпох.

Уточнены механизмы процесса межклеточной агрегации клеток-мишеней (тимоциты крыс, нейтрофилы человека) и бактерий Е. соН в смешанной суспензии и показано, что маннозоспецифичные контакты обеспечивают взаимоузнавание этими клетками друг друга. Найдено, что изменение температуры выступает в качестве триггера реакции межклеточной агрегации с участием бактерий и обнаружено, что образование маннозорезистентных контактов блокируется под действием ингибиторов окислительного метаболизма фагоцитов.

На разнообразном клиническом материале показана применимость пектиновых тестов (агрегация клеток, генерация супероксида и Н2О2, дегрануляция) для изучения нарушений функциональной активности неитрофилов при раке легкого, гортани, прямой кишки, а также при хронических бактериальных инфекциях дыхательных путей.

Установлено, что повышенная концентрация [NCV+NOaT в плевральных экссудатах (ПЭ) является индикатором рака легкого и выявлена взаимосвязь между этим параметром и экспрессией рецепторов для glcNAc и ганглиозида GM) на поверхности клеток ПЭ.

Практическая значимость полученных результатов. Основными отраслями практического применения полученных результатов является биотехнология, фармакология, здравоохранение и народное образование. Результаты исследований создают научную и теоретическую базу для целенаправленного использования пектинов, включая пектины лекарственных растений и эндогенные пектины животных и человека, в биомедицинских исследованиях в качестве стимуляторов функциональной активности клеток. Лектины перспективны для применения в цитоэкологических исследованиях в качестве индикаторов действия на клетки патогенных факторов внешней среды. Разработанные пектиновые тесты могут бьгть использованы в качестве новых методов для дифференциальной диагностики рака и бактериальных инфекций. Результаты работы создают основу для развития современных технологий получения лекарственных препаратов и диагностических средств нового типа, действие которых основано на лектинспецифических взаимодействиях.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Активирующее действие галактозидспецифичного пектина омелы белой VAA на клетки иммунной системы определяется его углеводсвязывающей В-субъединицей, обеспечивающей запуск процессов трансмембранной сигнализации в клетках. Отдельные аспекты сигнальной активности VAA присущи ряду эндогенных пектинов животных и человека, которые совместно с другими гликобиологическими факторами (аи-кислый гликопротеин и его гликоформы, углеводспецифичные иммуноглобулины) образуют лектинэависимую систему регуляции клеточных функций в организме.

2. Применение лектиное и сульфатированных полисахаридов позволяет выявить нарушения механизмов функционирования клеток, связанных с процессами клеточной агрегации, шеддинга мембранных рецепторов и изменением НАДФН-оксидазной активности нейтрофилов при действии факторов внешней среды (тепловой шок, УФ-облучение и сульфгидрильные реагенты).

3. Взаимодействия бактериальных клеток Є. coli с клетками-мишенями (тимоциты крыс, нейтрофилы человека), основанные на маннозоспецифических контактах, имеют обратимый характер и зависят от метаболической активности клеток и температуры.

4. Пектиновые тесты, основанные на анализе ранних стадий функционального ответа нейтрофилов, могут использоваться в качестве дополнительных диагностических средств в биомедицинских исследованиях.

Личный вклад соискателя. Выбор и обоснование научной тематики исследований, постановка экспериментов, анализ полученных результатов и их интерпретация были сделаны автором самостоятельно. Все основные научные результаты, представленные в диссертации, получены лично автором.

Апробация результатов диссертации. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на заседаниях научного семинара кафедры биофизики Белгосуниверситета (1989-1997 гг.), Всесоюзной конференции "Структурная динамика биологических мембран и ее роль в регуляции фотобиологических и рецепторных процессов" (Минск, 1988), Всесоюзном совещании "Актуальные вопросы клеточной биологии" (Ленинград, 1989), конференции молодых ученых "Биохимия л биофизика клеточных процессов" (Минск, 1990), 1 Иммунологическом съезде Белоруссии "Экологические проблемы иммунологии и аллергологии" (Минск, 1990), Всесоюзном симпозиуме "Биохимия опухолевой клетки" (Минск, 1990), 9 Международном симпозиуме по аффинной хроматографии и биологическому узнаванию (Иокогама, 1991), 15 Международной конференции по пектинам (Сегед, 1993), 1 и 2 съездах Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994, 1996), 8 Симпозиуме по экспериментальным исследованиям рака Немецкого Ракового Общества (Хайдельберг, 1995), 8 съезде оториноларингологов Украины (Киев, 1995), 2 Международной конференции по лазерной физике и спектроскопии (Гродно, 1995), 4 съезде оториноларингологов Республики Беларусь (Витебск, 1996), Международном симпозиуме "Кислород и свободные радикалы" (Гродно, 1996), 1 Международной конференции UICC по исследованию рака

(Вена, 1997), научной конференции "Современное состояние и перспективы развития фундаментальных направлений медико-биологических наук в Беларуси" (Минск, 1997).

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 53 научные работы, включая 2 раздела в книгах издательств Springer и Humana Press, 31 публикацию в журналах (из них 5 научных обзоров) и 1 авторское свидетельство на изобретение.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, общей характеристики работы, методической главы, 5 экспериментальных глав с собственными результатами и их обсуждением, заключения, выводов, списка использованной литературы (494 источника) и приложения (обзоры по теме диссертации). Она изложена на 295 страницах и содержит 98 рисунков и 25 таблиц.