Введение к работе
Актуальность темы. Явление электрического пробоя биологических мембран получило в последние годы широкое распространение в первую очередь за счет практического применения. Особое место занимает новое направление использования электропоранин как инструмента обратимой пермеабилизации мембран для изучения клеточной физиологии и биохимии. В то же время ЭТОТ метод часто используется без надлежащего изучения реальной степени и длительности электропермеабилизации, что может приводить к ошибочным заключениям и выводам.
Использование в настоящей работе в качестве объекта исследования нейтрофилои'крови человека определяется как особой ролью этих клеток в формировании неспецифического иммунитета, так и возможностью регистрации их функциональной активности хемилюмннеспентным методом. Высокочувствительный хсмилюминесцентный метод позволяет изучать продукцию нейтрофиламп активных форм кислорода в режиме реального времени. Изучение механизма индукции хемнлюминесцентного отпета нейтрофилов о результате электрического пробоя плазматической мембраны импульсами внешнего поля имеет не только самостоятельное научное значение. Электроактнвация может быть использована как способ активации респираторного взрыва нейтрофилов для клинической диагностики их фагоцитарного статуса.
Цель и задачи неелсдопания. Целью настоящей работы являлось изучение механизма активации респираторного взрыва нейтрофилов кропи человека одиночными импульсами внешнего электрического поля. В ходе работы требовалось решить следующие задачи:
1. Продемонстрировать, что нейтрофилы человека.так же как и макрофаги
4 крыс, отвечают вспышкой люминол-зависимой хсмилюминесценции на импульс внешнего электрического поля:
-
Изучить влияние состава среды и параметров электрического импульса на величину хсмилюминесцентного ответа, определить оптимальные условия активации нейтрофилов;
-
Детально исследовать роль ионов кальция в механизме электроактивации нейтрофилов;
-
Определить эффективность пермсабилизацни мембран при выбранных условиях: средний диаметр, количество и время жизни пор, обеспечивающих проницаемость мембраны для ионов Са2+.
Научная новизна полученных результатов. Обнаружен эффект прямой активации хсмилюминесценции суспензии нейтрофилов человека одиночными импульсами внешнего электрического поля. В результате экспериментального исследования эффекта активации установлено кратковременное увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция вследствие вхождения через образующиеся в плазматической мембране поры. Анализ данного явления различными экспериментальными методами доказывает, что ключевым звеном в механизме активации является вхождение ионов Са2+ из среды в клетки. Обнаружена высокая буферная емкость внутриклеточных кальциевых депо, поддерживающих низкую концентрацию свободного кальция в цитоплазме нейтрофилов. Определены численные значения параметров пор: время жизни, площадь, количество пор. На основе обнаруженного эффекта предложено устройство для активации нейтрофилов импульсами электрического поля', защищенное патентом.
Научно-практическое значение работы. Обнаруженный в диссертационной работе эффект активации респираторного взрыва нейтрофилов
5 человека одиночными импульсами внешнего электрического поля может
применяться в медико-биологических исследованиях, а также в целях
медицинской диагностики фагоцитарной активности нейтрофилов как
стандартный метод активации фагоцитарных клеток.
Полученные в результате диссертационной работы численные значения
времени жизни, количества и площади электропор, а также высокая емкость
внутриклеточных кальциевых депо позволяют критически взглянуть на многие
результаты, полученные другими авторами. Прогнозирование на основе
полученных данных реальной степени электропермеабилизации нейтрофилов
даст возможность эффективно использован, метод электропорации для
коніролируемого введения d клетку физиологически важных молекул п научных
исследованиях.
Апробация диссертационной работы. Основные положения диссертации были доложены на III Всесоюзном совещании по хемилюминесценции /Рига, 1990 г./, II международной школе "Электромагнитные поля и биомембраны" /Плевей. Болгария, 1989 г./, VI международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хемилюминесценции /Кембридж, Англия, 1991 г./. Международной конференции "Клиническая хемилюминесценция"' /Берлин, Германия, 1994/. Результаты работы обсуждались на семинарах кафедры биофизики РГМУ и отдела медицинской электроники ИЗЭ РАН. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, 4 тезиса, получен патент Российской Федерации.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков, 1 таблицу. Перечень цитированной литературы включает250 ссылок.