Введение к работе
Актуальность темы. Диссертационная работа связана с проблемой
>егуляции размножения клеток и посвящена исследованию роли адгезии
слеток, межклеточных контактов, массопереноса между клетками и
титательной средой в регуляции роста однослойных и многослойных
:леточных культур. По сути, в работе рассматриваются две важные
іроблемьі биологии клетки в культуре. Первая проблема - каким
збразом адгезия минимально трансформированных и нормальных клеток
: твердым подложкам стимулирует их пролиферацию и,
:оответственно, рост клеточных культур. Эта проблема субстратной іависимости клеточной пролиферации включает в себя вопрос о том, ючему рост сильно трансформированных, опухолевых клеток, обычно, іе зависит от их адгезии к твердому субстрату <ТС). Вторая іроблема - какова роль межклеточных контактных взаимодействий, іеааслеточной адгезии в торможении роста однослойных культур шнимально трансформированных и нормальных клеток, каким образом южно устранить торможение роста однослойных культур и добиться жогослойного "тканеподобного" роста клеток, каковы особенности >егуляции многослойного роста. Понимание основ регуляции шогослойного роста нормальных и минимально трансформированных : леток является принципиальным не только в теоретическом плане, но і в практической цитотехнологии для выращивания многослоЯньк :леточных культур.
Изучению субстратной зависимости пролиферации клеток в штературе уделено достаточно много внимания. Однако вопрос о іеханизме этой зависимости до сих пор остается открытым. В конце Ю-х годов появились работы, в которых наметилась тенденция к ісследованию влияния адгезии клеток к подложке на внутриклеточные юказатели. В этих работах CMargolis et al.,1983, Schwartz et il.,1989) показано влияние адгезии клеток к ТС на внутриклеточный >Н
В исследовании плотностного торможения роста клеточных культур : началу 80-х годов сложилось представление о том, что причиной
торможения могут быть как ограничения иассопереноса между клетками и культуральной средой (диффузионные ограничения клеточного роста), так и межклеточные контактные взаимодействия (Васильев, Гельфанд, 1981). Однако оставалось неясным в какой степени каждый из этих факторов определяет торможение роста однослойных и многослойных клеточных .культур, каковы особенности стимуляции и торможения многослойного роста зависимых от прикрепления клеток в культуре.
Цель работы. Цель настоящей работы состояла в выяснении роли адгезии клеток в регуляции клеточного роста in vitro.
Основными задачами работы являлись;
Определение роли внутриклеточного рН в зависимости пролиферации клеток от их адгезии к твердому субстрату.
Выяснение роли межклеточной адгезии и диффузионных ограничений иассопереноса в регуляции однослойного и многослойного роста зависимых от прикрепления клеток в культуре
Изучение кинетики пролиферации и особенностей состояния клеток в многослойных клеточных культурах;
Разработка методов и аппаратуры выращивания и исследования многослойных клеточных культур.
Научная новизна.
На основе экспериментальных результатов сформулировано новое представление о связи пролиферации нормальных и минимально трансформированных клеток с влиянием их адгезии к ТС на pHi.
Используя разработанные оригинальные методики измерения рН и содержания кислорода непосредственно около клеток получено прямое экспериментальное доказательство определяющей роли иассопереноса в торможении роста однослойных культур.
Впервые показано, что торможение роста однослойных зависимых от прикрепления клеточных культур можно устранить за счет ускорения иассопереноса без механического влияния на нехклеточные контакты. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что причиной торможения роста изученных клеток в монослое являлись не межклеточные контакты, а ограниченный массоперенос.
- Теоретически предсказана и экспериментально подтверждена
возможность получения многослойного роста зависимых от прикрепления
клеток in vitro без перфузии путем выращивания на подложках с
малым радиусом кривизны, например, на тонких волокнах, за счет
быстрого диффузионного массопереноса.
Впервые на основе анализа диффузионной модели теоретически юказана и экспериментально подтверждена возможность управления іногослойньїм ростом клеток в культуре путем регуляци их диффузионного массообмена со средой.
Получены новые данные о кинетике пролиферации и об особенности состояния клеток в многослойных клеточных культурах в сравнении с однослойными неперфузируеными культурами.
— Обнаружено предельное ограничение роста многослойных
терфузируемых культур зависимых от прикрепления клеток при
їлотностях в 20-30 раз превышающих плотности насыщения однослойных
іеперфузируемьк культур.
На основе полученных экспериментальных данных сформулирована оригинальная гипотеза об определяющей роли межклеточных контактов з передаче сигналов стимуляции пролиферации зависимых от трикрепления клеток в многослойных культурах. Предложен механизм, обьясняющий предельное ограничение многослойного роста клеток in /itro.
Разработаны новые способы и аппаратура для исследования іараметров околоклеточной среды, для исследовани. адгезии клеток к твердому субстрату, для выращивания многослойных клеточных сультур.
Практическая ценность. Совокупность представленных в
диссертации данных можно рассматривать как значительный вклад в
эазвитие нового научного направления в биологии клетки в культуре,
з цитотехнологии - выращивание многослойных "тканеподобных"
слеточных культур. Представленные в диссертации результаты и
зыводы имеют практическую ценность как основа для разработки
іетодов выращивания многослойных клеточных культур.Принципиальными
являются данные о том, что не межклеточные контакты, а
ограниченный массоперенос определяет торможение роста зависимых
от прикрепления нормальных и минимально трансформированных клеток
з исследованных однослойных культурах. Важное практическое
значение имеют данные о кинетике пролиферации и об особенностях
іетаболизма клеток в многослойных культурах, о предельных
ограничениях роста многослойных клеточных культур, о механизме
зтого ограничения. Эти результаты учитывались при разработке
іредставленньїх в диссертации способов и аппаратуры для
зырадивания многослойных клеточных культур.
Результаты исследования зависимости пролиферации клеток от
- k -
адгезии к твердому субстрату и ее связи с pHi имеют практическую ценность, поскольку определяют конкретное направление в исследовании механизма субстратной зависимости пролиферации клеток. Они также представляют интерес для понимания того, почему рост опухолевых клеток, как правило, не зависит от их адгезии к твердому субстрату.
Практическую ценность имеют также результаты разработки методов исследования клеток в культуре, методов и аппаратуры для выращивания многослойных клеточных культур.
Результаты, представленные в диссертации, использовались в НПО "Биоприбор" АН СССР при разработке совместно с Институтом биологической физики АН СССР комплекса приборов для камерного культивирования клеток. Изложенные в диссертации положения, разработанные методы, аппаратура могут быть рекомендованы к внедрению в Институтах РАН, РАМН, Мин.Сельского Хозяйства, связанных с использованием клеточных культур в научных и практических целях.
Личный вклад автора. Результаты и выводы, представленные в диссертации, получены либо лично автором, либо при непосредственном участии автора.
Аппробация работы. Основные результаты работы докладывались на I международной конференции по измерениям в биологии и медицине ИМЕКО <1981 г., Суздаль), на I Биофизическом съезде (1982 г., Москва), на I, II, III, IV Всесоюзных совещаниях по культивированию клеток животных и человека 1983, 1985, 1990, 1994 гг., Пущино), на I Международной конференции молодых ученых по биофизике <1985 г., Братислава), на III Всесоюзной конференции по производству ветеринарных биопрепаратов <1987 г., Москва), на Всесоюзной конференции "Гидродинамика и процессы переноса в биореакторах" С1988 г., Новосибирск), на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы клеточной биологии" <г.Ленинград, 1989 >, на совещании "Биология клетки в культуре" <1992 г., Санкт-Петербург), на международной конференции по нежклеточным коммуникациям <1994- г., Пущино)
Публикации. Основные результаты и выводы, представленные в диссертации, изложены в 27 публикациях в журналах и сборниках статей, в 10 тезисах в сборниках конференций, в 8 авторских свидетельствах на изобретение и патентах.
Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из 7 глав,